論文精讀 | Intra- and Inter-cellular Rewiring of the Human Colon during Ulcerative Colitis

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重要縮寫:

(1)DE gene:differentially expressed gene谱净,差異表達(dá)基因

(2)CAFs:cancer-associated fibroblasts搞挣,癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞

(3)IAFs:inflammation-associated fibroblasts暑中,炎癥相關(guān)成纖維細(xì)胞

(4)Mcell:Microfold (M) cells所坯,微折疊樣細(xì)胞

(5)CRC:結(jié)直腸癌

(6)UC:Ulcerative Colitis纳胧,潰瘍性結(jié)腸炎


Intra- and Inter-cellular Rewiring of the Human Colon during Ulcerative Colitis

人類結(jié)腸在潰瘍性結(jié)腸炎期間出現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間的重構(gòu)


全文邏輯結(jié)構(gòu):

1. 繪制結(jié)腸組織的單細(xì)胞表達(dá)譜

2. 細(xì)胞亞群鑒定,介紹有意義的新的功能細(xì)胞亞群

3. 與健康組織相比,疾病期間結(jié)腸組織的細(xì)胞亞群比例的改變以及特有細(xì)胞亞群的出現(xiàn)

4. 細(xì)胞亞群在不同疾病狀態(tài)(健康厉碟、非炎癥喊巍、炎癥)下表達(dá)譜的改變(主要是上皮、免疫細(xì)胞群的改變)

5. 分析UC患者介導(dǎo)抗TNF治療的細(xì)胞亞群的種類和抗藥性機(jī)制

6. 通過(guò)分析細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)箍鼓,發(fā)現(xiàn)隨疾病狀態(tài)改變崭参,細(xì)胞亞群的區(qū)室化作用如何改變

7. 利用配-受體關(guān)系,建立預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)細(xì)胞亞群數(shù)量關(guān)系

亮點(diǎn):

①分析19名潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者和12名健康人結(jié)腸粘膜中近37萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組款咖,鑒定出51種細(xì)胞亞群何暮,主要是上皮、基質(zhì)和免疫細(xì)胞铐殃;

②M樣細(xì)胞海洼、炎性單核細(xì)胞、炎性成纖維細(xì)胞(IAF)富腊、CD8+IL-17+T細(xì)胞坏逢,在UC中增多,是細(xì)胞間互作的核心赘被;

③炎性單核細(xì)胞和IAF可能分別通過(guò)表達(dá)抑瘤素M(OSM)及其受體是整,介導(dǎo)抗TNF治療的耐藥性;

④許多UC風(fēng)險(xiǎn)基因具有細(xì)胞類型特異性民假,根據(jù)基因共表達(dá)情況浮入,可將過(guò)半數(shù)的風(fēng)險(xiǎn)基因歸于10個(gè)模塊(基因調(diào)控通路);

⑤基因在細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)允許推斷風(fēng)險(xiǎn)基因之間的潛在的因果性基因羊异。

摘要:全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的風(fēng)險(xiǎn)等位基因事秀。為了解它們的細(xì)胞類型特異性和作用途徑,我們從18個(gè)UC患者和12個(gè)健康人的結(jié)腸粘膜中獲取了366,650個(gè)細(xì)胞的圖集野舶,揭示51種細(xì)胞易迹,主要分上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞三大類筒愚,包括BEST4?+腸上皮細(xì)胞赴蝇,微折疊樣細(xì)胞和IL13RA2?+?IL11?+炎性成纖維細(xì)胞,這與抗TNF治療的抗藥性相關(guān)巢掺。共表達(dá)CD8 and IL-17的IAF句伶、炎癥單核細(xì)胞、微折疊樣細(xì)胞和T細(xì)胞隨著疾病的發(fā)展而擴(kuò)增陆淀,形成細(xì)胞間相互作用的樞紐考余。許多UC風(fēng)險(xiǎn)基因是細(xì)胞類型特異性的,并且受到相對(duì)較少的基因調(diào)控通路的共同調(diào)控轧苫。在這些觀察的基礎(chǔ)上楚堤,我們提名并推斷了GWAS基因座中特定風(fēng)險(xiǎn)基因的功能疫蔓。這項(xiàng)工作不僅鑒定出在炎癥性腸病(IBD)這個(gè)疾病模型中一些已知的風(fēng)險(xiǎn)基因在不同細(xì)胞類型和信號(hào)通路的分布身冬,同時(shí)為今后利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)去尋找疾病的成因以及治療方法提供了一個(gè)很好的技術(shù)框架衅胀。

關(guān)鍵詞:炎癥性腸病酥筝;潰瘍性結(jié)腸炎滚躯;炎癥;抗TNF抵抗嘿歌;大腸掸掏;結(jié)腸;單細(xì)胞RNA-seq宙帝;單細(xì)胞基因組學(xué)丧凤;細(xì)胞間相互作用;全基因組關(guān)聯(lián)研究.

1. Introduction

組織通過(guò)多種上皮細(xì)胞步脓、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的協(xié)同作用發(fā)揮功能愿待。由于原發(fā)的細(xì)胞功能障礙或其他試圖重建體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞的代償作用,任何區(qū)室的破壞都可能導(dǎo)致疾病靴患。這種相互作用關(guān)系可能使人們很難確定疾病基礎(chǔ)的因果機(jī)制呼盆。在結(jié)腸粘膜的特殊情況下,破壞會(huì)導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎(UC)發(fā)生蚁廓,這是一種炎癥性腸病(IBD)厨幻。

已知的疾病風(fēng)險(xiǎn)等位基因突出了IBD發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵通路相嵌,包括先天性的和適應(yīng)的免疫,即腸道屏障功能以及病原體感知和反應(yīng)况脆。然而饭宾,潛在的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的基因尚未被對(duì)應(yīng)到其細(xì)胞亞群和作用路徑。此外格了,盡管內(nèi)鏡檢查后的組織病理學(xué)分析是當(dāng)前的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)看铆,但它未能捕獲到疾病的精細(xì)細(xì)節(jié),例如細(xì)胞比例盛末、特定細(xì)胞類型的表達(dá)弹惦、細(xì)胞間的相互作用,并且不能區(qū)分慢性炎癥和疾病的恢復(fù)悄但。

單細(xì)胞RNA測(cè)序?(scRNA-seq) 通過(guò)全面繪制組織中的細(xì)胞類型和狀態(tài)棠隐,從細(xì)胞頻率的變化解開(潰瘍性結(jié)腸炎期間的)基因程序表達(dá)的變化,并通過(guò)細(xì)胞間相互作用(細(xì)胞微環(huán)境)連接細(xì)胞頻率的變化和基因程序表達(dá)的變化檐嚣,從而幫助促進(jìn)我們對(duì)人類疾病的理解助泽。在這里,我們將單細(xì)胞RNA測(cè)序應(yīng)用在UC上,使用從健康人和潰瘍性結(jié)腸炎患者中收集的活檢腸道樣本生成和查詢健康和患病結(jié)腸的單細(xì)胞圖譜嗡贺。

2. Results

2.1 scRNA-Seq Atlas of Colon Biopsies from Healthy Individuals and UC Patients

我們從18名治療方案各異的UC患者和12名健康人的結(jié)腸鏡檢查中獲取了68份活檢樣本(每份~2.4mm2)隐解,進(jìn)而獲得了366,650個(gè)高質(zhì)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組?(Figure?1A;?STAR Methods;?Table S1)。我們分兩個(gè)階段進(jìn)行了研究:從7例UCC患者和10例健康人身上收集到的34例結(jié)腸活檢樣本及相應(yīng)的115,517例單細(xì)胞譜作為訓(xùn)練集(Figure?1A;?STAR Methods;?Table S1)诫睬,從另外的11例UC患者和2例健康人身上收集到的34例結(jié)腸活檢樣本及相應(yīng)的251,133例單細(xì)胞譜作為測(cè)試集煞茫。

為研究健康粘膜和發(fā)炎粘膜的過(guò)渡,同時(shí)減少患者個(gè)體特異性的變異岩臣,我們收集了每名受試者的配對(duì)樣本溜嗜。對(duì)于UC患者,配對(duì)樣本是指內(nèi)窺鏡下評(píng)估為鄰近正常組織的(非發(fā)炎)組織和發(fā)炎或潰瘍的組織(發(fā)炎)(Figure?1A;?STAR Methods)架谎。為了估計(jì)這種變異炸宵,我們從12名健康受試者以及3名UC患者的非發(fā)炎和發(fā)炎區(qū)域分別獲得了兩個(gè)位置匹配的樣本(距離約為1-2 cm)。然后谷扣,我們從每個(gè)樣本中分離出“上皮”(EPI)和“固有層”(LP)成分土全,并進(jìn)行了scRNA-seq(STAR Methods)。我們證實(shí)会涎,炎癥相關(guān)基因集的表達(dá)在健康樣本裹匙、非發(fā)炎樣本和發(fā)炎樣本間逐漸增加(Figure?1B)

(A)研究設(shè)計(jì)末秃。另請(qǐng)參閱表S1概页。(B)確認(rèn)炎癥狀態(tài)。顯示的是健康(藍(lán)色)练慕,未發(fā)炎(綠色)和發(fā)炎(紅色)活檢組織中炎癥信號(hào)的平均表達(dá)(STAR方法)(Wilcoxon試驗(yàn)惰匙,??p = 0.05;????p = 0.01;?? ???p = 0.001);箱線圖:25%铃将,50%和75%的分位數(shù);?誤差線:SD项鬼。(C)細(xì)胞普查。顯示的是按細(xì)胞子集著色的細(xì)胞的t-隨機(jī)鄰域嵌入(t-SNE)(圖例劲阎;STAR方法)绘盟。(D)特定于子集的標(biāo)記。顯示的是按細(xì)胞譜系關(guān)系(頂部悯仙,顏色圖例龄毡;STAR方法)排序的跨子集(列)的標(biāo)記基因(行)的表達(dá)。(E)樣品之間的可重復(fù)細(xì)胞亞群分布(發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證集)雁比。顯示的是來(lái)自每個(gè)健康(藍(lán)色)稚虎,未發(fā)炎(綠色)或發(fā)炎(紅色)樣品的每個(gè)細(xì)胞亞組(條形)中的細(xì)胞分?jǐn)?shù)(y軸)。下圖:子集中的總細(xì)胞數(shù)(另請(qǐng)參見圖S1?A)偎捎。(F)上皮分化蠢终。顯示的是上皮細(xì)胞亞群(包括吸收譜系(右)和分泌譜系(左))的推斷分化軌跡(STAR方法)序攘。(G—I)新的結(jié)腸細(xì)胞亞群及其標(biāo)記。顯示的是跨子集(行)(G和I)的選擇標(biāo)記基因(列)的表達(dá)細(xì)胞分?jǐn)?shù)(點(diǎn)大醒胺鳌)和表達(dá)細(xì)胞的平均表達(dá)水平(點(diǎn)顏色)程奠,以及結(jié)合的單分子熒光原位雜交的代表性圖像(smFISH)和結(jié)腸組織微陣列(TMA;?STAR方法)的免疫熒光測(cè)定(IFA),用于健康結(jié)腸(H)中的BEST4?+腸上皮細(xì)胞(左祭钉,白箭頭)和RSPO3?+成纖維細(xì)胞(右瞄沙,白箭頭)。插圖慌核,×3放大倍率距境;比例尺,50μm垮卓。

2.2 A Comprehensive Census of 51 Cell Subsets and Their Molecular Signatures

51個(gè)細(xì)胞亞群及其分子特征的全面普查

經(jīng)過(guò)scRNA-seq垫桂,單細(xì)胞測(cè)序圖譜通過(guò)聚類將所有的細(xì)胞劃分為51個(gè)細(xì)胞亞群(圖1C,經(jīng)過(guò)技術(shù)和生物變異校正后粟按;STAR方法)诬滩,并用已知的Markers進(jìn)行了標(biāo)注(圖1D)。我們聚類的細(xì)胞亞群的結(jié)果是魯棒的且具有可重復(fù)性的灭将,這是因?yàn)閹缀?b>所有的細(xì)胞亞群都由全部的樣本所代表(圖1E)疼鸟,并且各種細(xì)胞亞群的細(xì)胞數(shù)按比例分布在患者個(gè)體之間(Figures S1A and S1B)。發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列是高度一致的(圖S1B-S1D)庙曙,從相同疾病狀態(tài)下的相同甚至不同個(gè)體收集的重復(fù)數(shù)據(jù)也是如此(圖S1E空镜;STAR方法)。

這51個(gè)子集包括15個(gè)上皮細(xì)胞亞群捌朴,沿著從腸道干細(xì)胞(ISC)到成熟細(xì)胞命運(yùn)的分化軌跡排序(Haber等人姑裂,2017年?;?圖1?F;?STAR方法)。除此之外男旗,還包括8個(gè)成纖維細(xì)胞,4個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞欣鳖,1個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞察皇,7個(gè)髓樣細(xì)胞,4個(gè)B細(xì)胞泽台,10個(gè)T細(xì)胞(CD4?+傳統(tǒng)T輔助細(xì)胞[Tconv?]什荣,調(diào)節(jié)性T [T?reg?],CD8?+和γδ) 怀酷,1個(gè)先天淋巴樣細(xì)胞(ILC)和1個(gè)自然殺傷(NK)細(xì)胞亞群(圖1?C)稻爬。缺少的細(xì)胞類型包括粘膜下腸神經(jīng)元,需要通過(guò)單核RNA-seq進(jìn)行分離(Habib等人蜕依,2016)桅锄,漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(DC)和中性粒細(xì)胞(Schelker等琉雳,2017)。每個(gè)亞群都有已知和新穎的markers圖1?D友瘤;表S2)支持翠肘,包括轉(zhuǎn)錄因子(TF),G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和細(xì)胞因子(圖S2?A–S2C辫秧;表S3)束倍。在大多數(shù)樣本的單細(xì)胞測(cè)序聚類下,試圖在已有的51種細(xì)胞亞群下進(jìn)一步聚類為更少的群組的嘗試不會(huì)成功盟戏。例外情況包括绪妹,免疫球蛋白A(IgA)和IgG漿細(xì)胞,以及共表達(dá)TN FRS F4/OX40和RSF18/GITR的Treg細(xì)胞柿究,Treg細(xì)胞的共表達(dá)可能反映活化的Treg細(xì)胞與靜止的Treg細(xì)胞邮旷。

2.3 Characterization of?BEST4+?Epithelial Cells and?RSPO3+?Fibroblasts in the Healthy Colon

健康結(jié)腸中BEST4 +上皮細(xì)胞和RSPO3 +成纖維細(xì)胞的表征

我們的全面調(diào)查顯示,表達(dá)BEST4的腸上皮細(xì)胞不同于其他上皮細(xì)胞(Parikh等笛求,2019)廊移,富含與pH感應(yīng)和電解質(zhì)平衡有關(guān)的基因(原位驗(yàn)證;圖1?G,1H和S1D)探入〗瓶祝基因包括了Otopetrins?2和Otopetrins3?(OTOP2/3),這些質(zhì)子通道可檢測(cè)pH值并構(gòu)成酸味感知的基礎(chǔ)(Tu等人蜂嗽,2018年);?碳酸酐酶VII(CA7)苗膝,可催化碳酸氫鹽的形成采记;和Bestrophin-4(BEST4)伶跷,它們可能排出碳酸氫鹽(Qu和Hartzell,2008)背伴。BEST4?+腸上皮細(xì)胞約占兩名克羅恩膊「健(CD)患者回腸上皮的1%(11,473個(gè)細(xì)胞问窃;數(shù)據(jù)未顯示)。

多個(gè)成纖維細(xì)胞亞群因WNT/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)基因的表達(dá)而不同完沪,可能反映了沿隱窩-絨毛軸的不同位置(Powell等人域庇,2011?;?Shoshkes-Carmel等人,2018)覆积。一些富含WNT2B听皿,WNT4DKK3,表明它們位于隱窩附近宽档,而另一些富含BMP4尉姨,BMP5WNT5A / B并可能靠近絨毛(圖1?I)。據(jù)報(bào)道吗冤,這些基因中有許多是上皮下上皮細(xì)胞的標(biāo)志物又厉,上皮下的上皮細(xì)胞是支持上皮的罕見成纖維細(xì)胞群體(Shoshkes-Carmel等人九府,2018);?但是,在我們的數(shù)據(jù)中馋没,這些基因表達(dá)產(chǎn)物廣泛分布在所有細(xì)胞亞群中(例如FOXL1昔逗,DKK3WNT5B圖1?I)篷朵。

表達(dá)WNT2B?+的成纖維細(xì)胞的一個(gè)亞群可能通過(guò)與ISC受體LGR5相互作用的R-spondin-3(原位驗(yàn)證勾怒,圖1?G-1I)表達(dá)來(lái)支持ISC生態(tài)位(de Lau等,2011)声旺。RSPO3?+成纖維細(xì)胞表達(dá)其他WNT / BMP信號(hào)基因和幾種不同的趨化因子(圖1?G和1I)笔链,這些因子可能將免疫細(xì)胞募集到ISC生態(tài)位(Biton等人,2018年)腮猖。它們還富含預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌(CRC)預(yù)后不良的基因Calon等人鉴扫,2015年),并可能通過(guò)促進(jìn)干細(xì)胞樣微環(huán)境來(lái)支持腫瘤生長(zhǎng)(圖S5A)澈缺。

圖2. UC時(shí)細(xì)胞組成的變化和分化(A)細(xì)胞比例變化坪创。顯示的是相對(duì)于健康(深藍(lán)色)而言,非發(fā)炎(淺藍(lán)色)和發(fā)炎(白色)樣品的細(xì)胞頻率(y軸)有顯著變化(Dirichlet多項(xiàng)式回歸姐赡,*調(diào)整后的p = 0.05莱预,**調(diào)整后的p = 0.01 ,***調(diào)整后的p = 0.001);?誤差線:SEM项滑。(B)發(fā)炎的結(jié)腸中B細(xì)胞中漿細(xì)胞的相對(duì)減少依沮。左:來(lái)自健康(左)和發(fā)炎(中)人結(jié)腸的TMA中漿細(xì)胞的smFISH和IFA結(jié)合的代表性圖像;黃色箭頭枪狂,漿細(xì)胞危喉;紅色箭頭,B細(xì)胞州疾;比例尺辜限,50μm;?插圖,×2.5放大倍率严蓖。右:視野中總B細(xì)胞(y軸)中漿細(xì)胞的比例(每種情況n = 9次活檢列粪;*?p <0.05,t檢驗(yàn)谈飒;誤差線:SEM)。(C)在發(fā)炎的結(jié)腸中擴(kuò)大IAF态蒂。左:來(lái)自健康(左)和發(fā)炎(中)人結(jié)腸的TMA中IAF的smFISH和IFA結(jié)合的代表性圖像杭措;比例尺,50μm钾恢。右:在視(100微米的場(chǎng)IAFS(y軸)的數(shù)目2每圖像; N = 9和n = 7健康和發(fā)炎的活檢手素,分別; ***?P <5×10?-4鸳址,t檢驗(yàn);誤差條:SEM)。(D)減少上皮祖細(xì)胞的疾病泉懦。顯示的是根據(jù)疾病狀態(tài)著色的吸收性(頂部)和分泌性(底部)上皮細(xì)胞的擴(kuò)散偽時(shí)間(STAR方法)的分布稿黍,在疾病期間均顯著轉(zhuǎn)移到了后來(lái)的偽時(shí)間(似然比檢驗(yàn),p = 10?-4)

2.4 Remodeling of the Colon’s Cellular Composition?during Disease

疾病期間結(jié)腸細(xì)胞組成的重塑

通過(guò)使用考慮成分依賴關(guān)系的多變量測(cè)試圖2?A)和單變量測(cè)試圖S3?A和S3B崩哩;STAR方法)巡球,發(fā)現(xiàn)在非發(fā)炎或發(fā)炎樣本中,許多細(xì)胞亞群的比例與健康對(duì)照組相比差異顯著邓嘹。例如肥大細(xì)胞(King等酣栈,1992),CD8?+?IL-17?+?T細(xì)胞(Tom等汹押,2016)和Treg細(xì)胞(Holmén等人矿筝,2006。?;?圖2?A棚贾,S3?A窖维,和S3B)比例的增加。

微褶(M)細(xì)胞通常與人小腸的淋巴樣組織相關(guān)妙痹,在這里铸史,它們對(duì)于識(shí)別腸道菌群很重要(Mabbott等,2013)细诸。在結(jié)腸中沛贪,在健康個(gè)體中很少發(fā)現(xiàn)M樣細(xì)胞,但在炎癥過(guò)程中擴(kuò)增了17倍(原位驗(yàn)證震贵;圖S3?A和S3D)利赋。它們高度表達(dá)幾種趨化因子(例如,CCL20CCL23猩系;圖1?G)媚送,表明參與了將免疫細(xì)胞募集到炎癥部位的進(jìn)程。

粘液層缺陷(Xavier和Podolsky寇甸,2007年)無(wú)法通過(guò)表達(dá)的變化來(lái)解釋塘偎,表明它們可能在轉(zhuǎn)錄后出現(xiàn)。盡管杯狀細(xì)胞的頻率沒(méi)有變化拿霉,但杯狀細(xì)胞祖細(xì)胞在炎癥過(guò)程中減少了吟秩,既是離散的細(xì)胞亞群(圖2?A),又是分化的連續(xù)體圖1?F和2?D绽淘;STAR方法)涵防。

盡管免疫細(xì)胞的總數(shù)隨疾病增加(Danese和Fiocchi,2011年)沪铭,但在B細(xì)胞譜系內(nèi)壮池,從漿細(xì)胞向?yàn)V泡(FO)細(xì)胞轉(zhuǎn)移(原位驗(yàn)證偏瓤;圖2?A和2B)。在漿細(xì)胞中椰憋,相對(duì)于IgG+細(xì)胞厅克,IgA?+細(xì)胞頻率降低(圖S3?C),這表明炎癥與免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換有關(guān)(Scott等橙依,1986)证舟。

2.5 An Inflammation-Associated Fibroblast Subset Is Unique to the UC Colon

炎癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞IAF亞群是UC結(jié)腸所特有的

雖然大多數(shù)成纖維細(xì)胞亞群均存在于健康個(gè)體和UC患者中,一種被稱為炎癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(IAFS)的亞群的細(xì)胞數(shù)在部分患者發(fā)炎組織中擴(kuò)增了189倍(>固有層細(xì)胞數(shù)的1%,原位驗(yàn)證, 圖2A和圖2C)票编。IAFs在許多與結(jié)腸炎褪储、纖維化和癌癥相關(guān)的基因上活躍表達(dá),包括?IL11,?IL24, and?IL13RA2?(Figure?1G). 白細(xì)胞介素-11 (IL-11)是小鼠和潛在的人類纖維化的調(diào)節(jié)劑(Schafer等人慧域,2017)鲤竹。IAFs包括了WNT2B+?and?WNT5B+亞群(圖S3E),表明它們可能沿隱窩-絨毛軸反映了不同的狀態(tài)昔榴。

IAF表達(dá)與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞(CAF)的標(biāo)志物辛藻,包括FAP,TWIST1和WNT2互订。 IAF標(biāo)記物的表達(dá)水平與414個(gè)二代測(cè)序的RNA-seq 大腸癌樣本之間的相關(guān)性高于對(duì)照(Cancer Genome Atlas, 2012;?Figure?S5B; Spearman’s ρ?=?0.67)吱肌,這表明IAFs在腫瘤中的擴(kuò)展Figure?S5B。

圖3. 在非發(fā)炎和發(fā)炎的組織中共有的譜系特異性和細(xì)胞特異性表達(dá)變化(A–G)譜系和細(xì)胞特異性表達(dá)的變化由非發(fā)炎和發(fā)炎的組織與健康組織共享仰禽。(A–F)疾病狀態(tài)(STAR方法)共有的DE基因及其在炎癥過(guò)程中的效應(yīng)大械(離散的DE系數(shù),x軸)和統(tǒng)計(jì)顯著性(y軸)吐葵。選擇的基因突出顯示规揪;所有標(biāo)記基因均記錄在表S2中。(A–C)(A)上皮温峭,(B)先天(基質(zhì)和骨髓)或(C)適應(yīng)性區(qū)室中多個(gè)細(xì)胞亞群之間的共享變化猛铅。(D–F)上皮(D),先天(E)和適應(yīng)性(F)區(qū)室中特定細(xì)胞亞群的獨(dú)特變化凤藏。(G)在至少一種疾病狀態(tài)下顯著DE的基因的非發(fā)炎(x軸)和發(fā)炎(y軸)樣本與健康樣本的離散DE系數(shù)估計(jì)值(96,445個(gè)子基因系數(shù)奸忽,Spearmanρ= 0.71 ,p <10?-16)揖庄。(H)在發(fā)炎的結(jié)腸中上皮MHC II類表達(dá)的上調(diào)栗菜。顯示的是來(lái)自健康(左)和發(fā)炎(右)人結(jié)腸的TMA的上皮細(xì)胞smFISH和IFA結(jié)合的代表性圖像。比例尺蹄梢,50μm;?插圖疙筹,×5放大倍率;虛線,HLA-DRA?+上皮細(xì)胞腌歉。

二、炎癥與非炎癥組織的表達(dá)譜變化

2.6 Most Expression Changes during Disease Are Shared by Non-Inflamed and Inflamed Tissue

疾病過(guò)程中大多數(shù)表達(dá)變化是由非炎癥和炎癥組織共同分擔(dān)的

為了確定與疾病相關(guān)的表達(dá)變化齐苛,我們將表達(dá)建模為反映1細(xì)胞亞群翘盖,2疾病狀態(tài)(健康,非發(fā)炎或發(fā)炎)和凹蜂,3校正環(huán)境RNA污染的技術(shù)協(xié)變量的總和馍驯。我們區(qū)分了上皮,先天或適應(yīng)性區(qū)室中跨細(xì)胞亞群共享的變化?(Figures 3A–3C and?S4A–S4C,?Table S4) 與每個(gè)亞群所獨(dú)有的變化(Figures 3D–3F and?S4D–S4F;?Table S4;?STAR Methods)玛痊。

內(nèi)窺鏡評(píng)估下的未發(fā)炎和發(fā)炎的組織具有相似的差異表達(dá)(DE)基因特征(Figure?3G;?Table S4)汰瘫,表明UC的轉(zhuǎn)錄特征在發(fā)炎之前或在消退后持續(xù)存在。在整個(gè)上皮細(xì)胞中擂煞,DE基因反映了通過(guò)激活先天免疫力來(lái)恢復(fù)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的嘗試(例如抗微生物和抗氧化防御途徑混弥,粘蛋白生物合成以及主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類機(jī)制)(validatedin situ;?Figures 3A, 3D, and 3H;?Biton et?al., 2018,?McDonald and Jewell, 1987)。在基質(zhì)內(nèi)对省,成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥蝗拿,纖維化和組織修復(fù)的基因,而內(nèi)皮細(xì)胞的變化支持組織血管形成(Figures 3B and 3E).蒿涎。在免疫細(xì)胞中哀托,髓樣和T細(xì)胞激活了共刺激和共抑制基因,而B細(xì)胞上調(diào)了IgG類轉(zhuǎn)換(上文中劳秋,相對(duì)于IgG+細(xì)胞仓手,IgA?+細(xì)胞頻率降低)和親和力成熟的基因(Figures 3C and 3F)。

2.7 Concerted?Metabolic?Shifts in Epithelial Cells during Inflammation

炎癥過(guò)程中上皮細(xì)胞的協(xié)同代謝變化

比較未發(fā)炎和發(fā)炎的UC組織(Figures S4A–S4F;?Table S4)玻淑,可以發(fā)現(xiàn)伴隨著發(fā)炎而來(lái)的一些上皮細(xì)胞的代謝改變嗽冒。例如,嘌呤代謝的改變(例如XDHURAD)可能會(huì)產(chǎn)生尿酸岁忘,與上皮損害相關(guān)?(Chiaro et?al., 2017)辛慰。上皮細(xì)胞誘導(dǎo)犬尿氨酸途徑?(Figure?4A),與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)(Sofia et?al., 2018)干像。犬尿酸受體GPR35是一個(gè)推定的風(fēng)險(xiǎn)基因(Huang et?al., 2017)帅腌。

在炎癥過(guò)程中對(duì)239個(gè)KEGG通路的變化作圖(Figures 4B and?S5C;?STAR Methods)揭示了腸上皮細(xì)胞的其他代謝變化,包括從氧化磷酸化到糖酵解的轉(zhuǎn)變麻汰,精氨酸生物合成酶的誘導(dǎo)(例如速客,NOS2ASS1),以及用于降解支鏈氨基酸的酶的下調(diào)五鲫,尤其是AUH(一種推定的風(fēng)險(xiǎn)基因)(Liu等溺职,2015)。腸上皮細(xì)胞還誘導(dǎo)了HIF1途徑,這是單核細(xì)胞糖酵解轉(zhuǎn)變的一個(gè)原因(Kelly和O'Neill浪耘,2015年)乱灵。這些變化可能是由于腸道細(xì)菌短鏈脂肪酸生產(chǎn)受損所致den Besten et al.,2013)七冲,因?yàn)樯掀ぜ?xì)胞下調(diào)了β-氧化途徑以及丁酸和丙酸的代謝途徑痛倚,但上調(diào)了膳食脂肪酸的途徑(例如,α-亞油酸)澜躺。

(A)?UC上皮細(xì)胞中犬尿氨酸途徑的誘導(dǎo)蝉稳。 (右)顯示的是跨細(xì)胞子集(列)的發(fā)炎與健康樣品中犬尿氨酸途徑的DE基因(行)(左)。 健康(灰色輪廓)或發(fā)炎(黑色輪廓)樣本中的點(diǎn)大小掘鄙,表達(dá)細(xì)胞的分?jǐn)?shù)耘戚; 點(diǎn)顏色,顯著的DE模型系數(shù) (B)UC中腸細(xì)胞的代謝重編程操漠。顯示的是混合線性模型在上皮亞群的發(fā)炎與健康樣品中捕獲的KEGG通路(行)的表達(dá)變化(顏色欄)收津。 黑色輪廓,q <0.05颅夺。(C)CD8 + IL-17 + T細(xì)胞在UC中誘導(dǎo)IL17A / F朋截,IL23R和細(xì)胞毒性,共同刺激和共同抑制程序吧黄。(D)CD4 + CD8 +細(xì)胞表達(dá)IL17A部服。 顯示的是發(fā)炎的人結(jié)腸TMA中CD4,CD8和IL17A的smFISH和IFA組合的代表性圖像(左)拗慨,顯示(插圖)CD4 + CD8-IL17A +(黃色輪廓;頂部面板從黃色插圖開始)和CD4 + CD8 ?+ IL17A +(紅色輪廓廓八,底部面板,紅色插圖)赵抢。(E)視場(chǎng)中的CD4-CD8 + IL17A +或CD4 + CD8 + IL17A +單元數(shù)(250μm2)

2.8 Induction of a Pro-Inflammatory IL-17 Response and Immune Checkpoints?in T Cell Subsets

T細(xì)胞亞群中誘導(dǎo)促炎性IL-17反應(yīng)和免疫檢查點(diǎn)

在T細(xì)胞中剧蹂,幾個(gè)CD4?+亞群上調(diào)了IL17A圖4?C),可能反映了IL17A表達(dá)每細(xì)胞增長(zhǎng)以及Th17細(xì)胞的擴(kuò)增烦却。出乎意料的是宠叼,在兩種疾病狀態(tài)下(炎癥和非炎癥),CD8?+亞群對(duì)IL17A的誘導(dǎo)最強(qiáng)(圖4?C-4E)其爵。原位分析揭示這兩個(gè)CD4?-和CD4?+細(xì)胞共表達(dá)CD8IL17A圖4?d和4E)冒冬。盡管CD8?+?IL-17?+T細(xì)胞已經(jīng)被報(bào)道了(Cortez等人,2014摩渺,Srenathan等人简烤,2016),CD4+?CD8?+?IL-17?+?T細(xì)胞在很大程度上未表征摇幻。這些細(xì)胞還激活了小鼠Th17致病性相關(guān)的細(xì)胞毒性程序和基因(例如RBPJIL23R横侦;圖3?F和4?C挥萌;Gaublomme等人,2015)枉侧,這可能會(huì)加劇組織損傷引瀑。T細(xì)胞的大多數(shù)亞群誘導(dǎo)了共刺激和共抑制程序(圖4?C),與抑制免疫激活的嘗試一致(Attanasio和Wherry榨馁,2016)伤疙。

三、耐藥性

2.9 TNF?Expression Shifts to Treg, FO B, and?CD8+IL-17+?T?Cells during Inflammation

炎癥期間TNF表達(dá)轉(zhuǎn)移至T?reg辆影,F(xiàn)O B和CD8?+?IL-17?+?T細(xì)胞(耐藥性)

單克隆抗TNF抗體是IBD的突破性療法,但是30%的IBD患者無(wú)反應(yīng)黍特,并且許多人獲得了耐藥性(Rutgeerts等蛙讥,2004)。腫瘤壞死因子(TNF)的表達(dá)在UC期間發(fā)生了變化灭衷,Treg細(xì)胞成為TNF表達(dá)的關(guān)鍵角色次慢。在CD8?+?LP和活化的CD4?+?Fos?hi?T細(xì)胞中,每細(xì)胞TNF基線表達(dá)最高翔曲,但在發(fā)炎的組織中迫像,TNF在Treg和FO B細(xì)胞中被誘導(dǎo)(原位驗(yàn)證;圖5?B和S5?D)瞳遍。當(dāng)估算由每個(gè)細(xì)胞亞群表達(dá)的TNF總量時(shí)(圖5?A)T?reg細(xì)胞闻妓,在健康組織中占TNF表達(dá)的1%,但在炎癥過(guò)程中占14%以上(僅次于活化的CD4?+?T細(xì)胞)掠械。

圖5. IAF和單核細(xì)胞通過(guò)OSM信號(hào)傳導(dǎo)與抗TNF耐藥相關(guān)..(A and B) T?reg細(xì)胞成為UC?中TNF表達(dá)的主要來(lái)源由缆。(A)在健康,未發(fā)炎和發(fā)炎的樣本(x軸)中每個(gè)細(xì)胞亞群表達(dá)的總TNF轉(zhuǎn)錄本的分?jǐn)?shù)(樣本間的平均值猾蒂,y軸)均唉。表示最多的子集會(huì)突出顯示(圖例)。(B)?炎癥期間T?reg細(xì)胞的TNF表達(dá)肚菠。左:組合smFISH和FOXP3舔箭,IFA的代表性圖像IL10,和TNFA在發(fā)炎的人結(jié)腸癌TMA蚊逢。FOXP3?+?IL10?+?TNF?-?(黃色輪廓;右上方层扶,從黃色插圖)和FOXP3?+?IL10?+?TNF?+(紅色輪廓;右下方,從紅色插圖)筆REG細(xì)胞被突出顯示时捌。插圖怒医,×5放大倍率;藍(lán)色虛線奢讨,隱窩在組織中的位置稚叹。右:FOXP3的數(shù)目+?IL10?+?TNF?+細(xì)胞中的視圖(250微米的場(chǎng)2)焰薄。n =每個(gè)條件5個(gè)樣品(??p <0.005,t檢驗(yàn)扒袖;誤差線:SEM)塞茅。(C)?MHCII?+髓樣細(xì)胞和IAF分別表達(dá)OSM和OSMR。顯示的是來(lái)自健康(左)和發(fā)炎(右)人結(jié)腸的TMA的smFISH和IFA組合的代表性圖像季率。上圖:II類MHC?+髓樣細(xì)胞(即炎性單核細(xì)胞或DC2s)野瘦,黃色箭頭。下:IAF飒泻,白色箭頭鞭光。比例尺,50μm泞遗。插圖惰许,×5放大倍率。(D–G)?IAF史辙,炎性單核細(xì)胞和DC2子集與抗TNF抵抗有關(guān)汹买。(D)選擇的細(xì)胞亞群(y軸)中的抗TNF抗性(左)和敏感性(右)的特征分?jǐn)?shù)(x軸)的分布;橫線:平均聊倔。(E)在選定的細(xì)胞亞群(行)中的抗TNF抗性簽名(列晦毙,按簽名等級(jí),底部條排序)中表達(dá)基因的平均表達(dá)水平(顏色)和細(xì)胞分?jǐn)?shù)(點(diǎn)大邪颐铩)见妒。箭,在IAF中表達(dá)最高的基因甸陌。(F) 藥物反應(yīng)者徐鹤,無(wú)反應(yīng)者和健康對(duì)照組的人類結(jié)腸活檢(y軸)的大分子?RNA-seq(Arijs等,2009)中細(xì)胞亞群(x軸)的特征分?jǐn)?shù)分布(Wilcoxon測(cè)試邀层, *** p <0.001)返敬;箱線圖:25%,50%和75%的分位數(shù);?誤差線:SD寥院。(G)TNF信號(hào)(KEGG)(x軸)相對(duì)于藥物耐藥性(左劲赠,y軸),藥物敏感性(中秸谢,y軸)和OSM信號(hào)(右圖)的特征評(píng)分(平均對(duì)數(shù)2?[TP10K + 1]) y軸)中的每個(gè)細(xì)胞子集(點(diǎn))凛澎,由譜系(顏色)和整個(gè)樣本的平均比例(大小)標(biāo)記估蹄。

2.10 IAFs and Inflammatory Monocytes Are Associated with Resistance?to Anti-TNF Therapy

IAF和炎性單核細(xì)胞與抗TNF治療的耐藥性相關(guān)

IAF中表達(dá)最活躍基因之一是推定的風(fēng)險(xiǎn)基因OSMRLiu等人塑煎,2015),以及預(yù)測(cè)抗TNF反應(yīng)的細(xì)胞因子抑瘤素?M(OSM)的受體(West等人臭蚁,2017)最铁。OSMOSMR過(guò)去被認(rèn)為分別由未知的髓樣和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(West等讯赏,2017)。OSM最富于炎性單核細(xì)胞和DC2冷尉,而OSMR最富于IAF(原位驗(yàn)證漱挎;圖5C)。伴隨著炎癥過(guò)程中這些亞群的擴(kuò)雀哨,上述發(fā)現(xiàn)使我們假設(shè)結(jié)腸的細(xì)胞重塑可能部分解釋了OSM與耐藥性之間的關(guān)系磕谅。

因此,基于對(duì)60位有反應(yīng)者和57位無(wú)反應(yīng)者對(duì)治療的bulk表達(dá)數(shù)據(jù)的薈萃分析(Wang等人雾棺,2016年?;?STAR方法)膊夹,我們對(duì)各個(gè)細(xì)胞亞群的抗TNF耐藥性敏感性的基因信號(hào)進(jìn)行了評(píng)分。藥物抗性信號(hào)在IAF捌浩、炎性單核細(xì)胞和DC2細(xì)胞中大量富集(圖5?D和5E)割疾,而在上皮細(xì)胞中則具有藥物敏感性信號(hào)圖5?D)。與耐藥性最相關(guān)的三個(gè)基因IL13RA2嘉栓,TNFRSF11B和IL11是?IAF的marker,在其他細(xì)胞中很少表達(dá)(圖5E)拓诸。一項(xiàng)逆向分析使用IAF基因信號(hào)侵佃,推斷了來(lái)自20個(gè)藥物反應(yīng)者和27個(gè)非反應(yīng)者的治療前的IAF的整體(bulk)表達(dá)數(shù)據(jù)水平(圖5?F;?STAR方法),證實(shí)了IAFs豐富的患者會(huì)對(duì)抗TNF治療產(chǎn)生抵抗奠支。因此馋辈,IAF可能與West等(2017)報(bào)道的OSM介導(dǎo)的抗性有關(guān)

潛在的耐藥機(jī)制是OSM與TNF協(xié)同作用(West等倍谜,2017)或表型復(fù)制迈螟。為了檢驗(yàn)這些假設(shè),我們研究了跨細(xì)胞亞群的TNF與OSM信號(hào)之間的關(guān)系尔崔。簽名在細(xì)胞亞群之間緊密相關(guān)(即使在刪除共享基因后也是如此)答毫,并且兩者均與耐藥性簽名相關(guān)(圖5?G)。這表明OSM表型為TNF季春,激活了IAF中的下游靶標(biāo)洗搂。因此,IAF和炎性單核細(xì)胞可能會(huì)在TNF阻滯期間補(bǔ)償载弄,從而導(dǎo)致耐藥性耘拇。

圖6. 細(xì)胞間相互作用的重塑|解釋了疾病期間|細(xì)胞比例的變化(A–C)顯示了疾病期間增長(zhǎng)的去區(qū)室化情況. 顯示的是在(A)健康、(B)非發(fā)炎和(C)發(fā)炎組織中估計(jì)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)宇攻。每個(gè)節(jié)點(diǎn)指一種細(xì)胞亞群惫叛,其顏色代表了譜系關(guān)系,面積代表了細(xì)胞比例逞刷。淺灰色和深灰色的線分別連接了疾病期間嘉涌,相對(duì)于空白模型妻熊,那些同源受體—配體對(duì)表達(dá)顯著增加?(p?< 0.05)和差異表達(dá)(p?< 0.05)的細(xì)胞亞群。(D)結(jié)腸炎相關(guān)的細(xì)胞亞群是相互作用網(wǎng)絡(luò)中的中心節(jié)點(diǎn)洛心。顯示的是健康固耘,非發(fā)炎和發(fā)炎網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)細(xì)胞子集(y軸)的平均居中性(x軸),顯示了排名最高的10個(gè)細(xì)胞子集和所有其他子集的平均值(底部欄)词身。E)每個(gè)小圖顯示厅目,對(duì)于通過(guò)受體-配體相互作用連接的一對(duì)細(xì)胞,配體在一個(gè)細(xì)胞亞群中的平均表達(dá)水平(x軸)和表達(dá)受體的細(xì)胞亞群的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化比例 軸)中的每個(gè)樣本法严,并以疾病狀態(tài)(顏色)標(biāo)記损敷。 虛線,最佳線性擬合深啤。(F) 示例LASSO模型解釋了樣本中CD8 + IL-17 + T細(xì)胞比例的變化拗馒,該變化是與沿譜系著色的其他細(xì)胞亞群表達(dá)的配體(邊緣標(biāo)記)的正(暗箭頭)和負(fù)(亮箭頭)關(guān)系的函數(shù)。(G)由(F)中的細(xì)胞間相互作用的LASSO模型(紅點(diǎn); STAR方法)解釋的每個(gè)細(xì)胞子集比例(x軸)的方差分?jǐn)?shù)(y軸)溯街,該統(tǒng)計(jì)量在100個(gè)無(wú)效模型中的分布 (黑點(diǎn); STAR方法)诱桂。 僅顯示具有顯著模型的子集(經(jīng)驗(yàn)p <0.05),并按解釋的遞減分?jǐn)?shù)從左至右排序呈昔。

2.11 Rewiring of Cell-Cell Interactions via Inflammation-Associated Cell Subsets during Disease

疾病期間基于炎癥相關(guān)細(xì)胞亞群細(xì)胞間相互作用重構(gòu)

為了更普遍地描述結(jié)腸炎期間細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的重塑挥等,我們將受體-配體對(duì)Ramilowski等,2015)映射到細(xì)胞亞群上堤尾,以構(gòu)建跨疾病狀態(tài)假定的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)圖6?A-6C)肝劲,識(shí)別出細(xì)胞亞對(duì)對(duì)具有比空模型明顯更多的受體-配體連接(STAR方法)。

健康的相互作用描繪了不同的細(xì)胞區(qū)室(圖6?A)郭宝,而疾病期間的DE基因靶向譜系間的串?dāng)_和減少的區(qū)室化(圖6?B和6C)辞槐,其中UC相關(guān)的細(xì)胞亞群充當(dāng)關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)中心(圖6?D)。在健康的粘膜中粘室,相互作用在很大程度上反映了腸道穩(wěn)態(tài)(例如榄檬,DC1細(xì)胞和T細(xì)胞;圖6?A衔统; p <0.05)丙号。相反,上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞和T細(xì)胞之間的非炎癥相互作用更為豐富(圖6?B缰冤;所有p <10?-4)犬缨,而炎癥組織顯示B細(xì)胞T細(xì)胞棉浸、巨噬細(xì)胞和CD8?+?IL-17?+T細(xì)胞之間相互作用的重新連接(圖6?C怀薛;所有p <10?-4)。UC相關(guān)亞群(例如M樣細(xì)胞迷郑,IAF和炎性單核細(xì)胞)是網(wǎng)絡(luò)中最中心的節(jié)點(diǎn)(圖6?D)枝恋,表明它們?cè)诓煌?xì)胞亞群之間介導(dǎo)信號(hào)创倔。

2.12 Cell-Cell Interactions Predict the Infiltration, Proliferation, and Differentiation of Cell Subsets during Inflammation

細(xì)胞間相互作用預(yù)測(cè)炎癥過(guò)程中細(xì)胞亞群的浸潤(rùn),增殖和分化

我們假設(shè)細(xì)胞亞群比例的變化可以用其他細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用基因的變化來(lái)解釋焚碌。為了測(cè)試這一點(diǎn)畦攘,我們查詢了所有細(xì)胞亞群對(duì),對(duì)于每個(gè)受體-配體對(duì)十电,檢查樣品中一個(gè)細(xì)胞亞群中配體的表達(dá)水平是否與樣品中表達(dá)其受體的細(xì)胞亞群的比例(包括自分泌相互作用)相關(guān)知押。該分析發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種重要的相互作用(圖6?E;表S5鹃骂;STAR方法)台盯。

例如,炎癥過(guò)程中上皮細(xì)胞對(duì)IL18的上調(diào)與表達(dá)其受體IL18R1的T?reg細(xì)胞比例增加相關(guān)圖6?E畏线; Spearman’s ρ= 0.68)静盅。在小鼠中,IL-18既抑制Th17分化寝殴,又允許T?reg細(xì)胞介導(dǎo)的腸道炎癥控制(Harrison等蒿叠,2015)。但是蚣常,上皮細(xì)胞在將Treg細(xì)胞募集到結(jié)腸中的作用尚不清楚市咽。表達(dá)IL22RA1的腸上皮細(xì)胞的頻率與調(diào)節(jié)腸再生的IL22的CD4 +激活的Foshi T細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)(Pelczar等人,2016?;?圖6?E; Spearman的p = 0.55)史隆。我們?cè)谌祟惤Y(jié)腸球體培養(yǎng)中驗(yàn)證了這種相互作用,其中與IL-22的孵育誘導(dǎo)了表達(dá)程序曼验,該表達(dá)程序與ISC相比在腸細(xì)胞中顯著豐富(圖S6?A泌射; p <10?-10;Wilcoxon測(cè)試)鬓照。

其他因素會(huì)促進(jìn)免疫細(xì)胞的募集(例如CXCL12促進(jìn)B細(xì)胞)和基質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)增(例如PDGFD對(duì)于周皮細(xì)胞熔酷;OSM對(duì)于IAF),或者是可能調(diào)節(jié)細(xì)胞存活豺裆,增殖或死亡的自分泌信號(hào)(例如MST1對(duì)BEST4?+腸上皮細(xì)胞拒秘;TNFSF10對(duì)毛細(xì)血管后小靜脈)(圖6?E)。最后臭猜,我們開發(fā)了最小絕對(duì)收縮和選擇算子(LASSO)回歸模型躺酒,以識(shí)別跨越多種細(xì)胞亞群的數(shù)目關(guān)系圖6?F,6G蔑歌,S6?B和S6C羹应;STAR方法)。例如次屠,CD8?+?IL-17+?T細(xì)胞的比例由上皮細(xì)胞园匹,T細(xì)胞雳刺,成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)的自分泌和旁分泌相互作用共同解釋圖6?F)。


圖7裸违。共同調(diào)控的風(fēng)險(xiǎn)基因模塊有助于預(yù)測(cè)IBD靶向的基因掖桦,途徑和細(xì)胞類型(A)?推定的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因的細(xì)胞類型特異性表達(dá)。顯示的是在健康和UC細(xì)胞(左)中供汛,僅在健康細(xì)胞(中)或UC細(xì)胞(右)中被鑒定為細(xì)胞特異性或譜系特異性的細(xì)胞亞群(行)中GWAS相關(guān)IBD風(fēng)險(xiǎn)基因(列)的平均表達(dá)枪汪。僅在UC細(xì)胞中。星號(hào)紊馏,在健康與UC之間具有明顯改變的特異性的基因料饥。(B)在疾病的特定亞類中推定IBD風(fēng)險(xiǎn)基因。顯示的是健康(x軸)和發(fā)炎(y軸)樣品中GWAS涉及的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因跨細(xì)胞亞群(以譜系朱监,顏色標(biāo)記)的平均表達(dá)岸啡。(C)通過(guò)細(xì)胞亞群內(nèi)的共表達(dá)元模塊對(duì)推定的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因進(jìn)行功能注釋。顯示的是通過(guò)使用健康(藍(lán)色)連續(xù)添加由IBD風(fēng)險(xiǎn)基因播種的每個(gè)元模塊(y軸)捕獲(實(shí)線)捕獲的GWAS涉及的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因的數(shù)量(底部x軸)和百分比(頂部x軸)或相對(duì)于空模型(虛線)的UC(紅色)單元格赫编。左標(biāo)簽巡蘸,細(xì)胞類型和種子基因。正確的標(biāo)簽擂送,是元模塊中與GWAS有關(guān)的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因悦荒。(D and E) 元模塊可幫助從GWAS風(fēng)險(xiǎn)基因座中提名因果IBD風(fēng)險(xiǎn)基因。(D)對(duì)于幾種基于scRNA-的方法嘹吨,IBD和UC的20個(gè)風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(左)和CD固有的22個(gè)風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(右)的正確預(yù)測(cè)的平均數(shù)(左y軸)和平均準(zhǔn)確度百分比(右y軸)相對(duì)于空模型(x軸)的seq搬味。***?p = 0.05,***?p = 0.01蟀拷,***?p = 0.001碰纬,NS =不顯著,Wilcoxon檢驗(yàn)问芬。(E)提名的風(fēng)險(xiǎn)基因悦析。顯示的是含有正確預(yù)測(cè)(白色)或不正確預(yù)測(cè)(灰色)的GWAS涉及的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因的基因座棍厂,與單個(gè)基因相關(guān)的基因座(金色)和所有其他基因座(綠色)球碉。錯(cuò)誤的預(yù)測(cè)會(huì)用預(yù)測(cè)的(頂部)和正確的(底部)基因進(jìn)行注釋妄田。

2.13 Many IBD Risk Genes Are Cell Type or Lineage Specific and Differentially Expressed in Disease

許多IBD風(fēng)險(xiǎn)基因是細(xì)胞類型或譜系特異性的艇肴,并且在疾病中差異表達(dá)

為了使用scRNA-seq詢問(wèn)IBD遺傳學(xué)磺陡,我們研究了跨越346個(gè)候選風(fēng)險(xiǎn)基因的151個(gè)IBD和UC風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)STAR方法)法褥。對(duì)于大多數(shù)基因座历葛,關(guān)聯(lián)信號(hào)背后的基因是未知的坞淮。但是墨微,在某些情況下陵刹,可能暗示單個(gè)基因,因?yàn)樗?xì)映射或非同義的編碼變體,或被解析為沒(méi)有其他基因的連鎖不平衡區(qū)域衰琐。使用這種方法也糊,我們編制了一組57個(gè)與GWAS相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因,這些基因很可能與IBD因果相關(guān)表S6羡宙;STAR方法)狸剃。

將這57個(gè)與GWAS相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因定位到我們的圖集上, 揭示了在疾病期間狗热,29個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因富集在特定譜系(圖7A)钞馁,36個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因顯著DE(?S7A和S7B)。除了已知的關(guān)聯(lián)(例如匿刮,NKX2-3在微血管細(xì)胞富集表達(dá)和HNF4A在腸上皮細(xì)胞富集表達(dá))(Stegmann et?al., 2006,?Wang et?al., 2000)僧凰,我們發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)新的關(guān)系(表S6)。例如熟丸,intelectin 1(ITLN1)训措,一種脂筏蛋白,定位于上皮刷狀緣(Wrackmeyer等光羞,2006)绩鸣,在不成熟的杯狀細(xì)胞中富集。一些細(xì)胞亞群被富集用于表達(dá)幾個(gè)GWAS相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因(圖7?B)纱兑。值得注意的是呀闻,M樣細(xì)胞以比其他細(xì)胞更高的水平表達(dá)許多風(fēng)險(xiǎn)基因(例如,NR5A2潜慎,CCL20JAK2捡多;圖7A表S6)铐炫,表明M樣細(xì)胞功能障礙可能在疾病中起重要作用垒手。

2.14 Co-variation of Gene Expression within a Cell Type?Helps Predict Functions for IBD Risk Genes

同一細(xì)胞類型內(nèi)基因表達(dá)的共改變有助于預(yù)測(cè)IBD風(fēng)險(xiǎn)基因的功能

我們假設(shè)相同亞組的單個(gè)細(xì)胞之間基因表達(dá)的變化可以使我們推斷IBD風(fēng)險(xiǎn)基因的功能。過(guò)去的方法通常在整個(gè)組織樣本中使用“guilt by association”驳遵,但無(wú)法區(qū)分表達(dá)的變化和細(xì)胞比例的變化淫奔。相比之下山涡,我們測(cè)量了細(xì)胞亞群內(nèi)單個(gè)細(xì)胞之間基因的共變堤结,從而使我們能夠分離出這些細(xì)胞中的共同調(diào)控過(guò)程(Tanay和Regev,2017年?;?STAR方法)鸭丛。

通過(guò)這種方式竞穷,我們?yōu)樗斜磉_(dá)的細(xì)胞亞群中的57個(gè)GWAS涉及的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因構(gòu)建了基因模塊,并用推定功能對(duì)其進(jìn)行了注釋(表S6鳞溉;STAR方法)瘾带。例如,在健康的上皮細(xì)胞內(nèi)熟菲,C1orf106模塊富含緊密連接和粘附連接基因(分別為q??<10?-6和10-2看政;Fisher精確檢驗(yàn))朴恳。我們最近表明C1orf106參與細(xì)胞-細(xì)胞連接(Mohanan等人,2018)允蚣。

2.15 Multiple IBD Risk Genes Co-localize in Shared Gene?Modules, Revealing Key Pathways in IBD

多個(gè)IBD風(fēng)險(xiǎn)基因共定位于共享基因模塊中于颖,揭示了IBD中的關(guān)鍵途徑

在許多情況下,多個(gè)推定的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因是同一基因模塊的成員嚷兔,這使我們能夠定義10個(gè)“元模塊”森渐,跨越GWAS涉及的IBD風(fēng)險(xiǎn)基因的50%以上,這可能反映了關(guān)鍵的疾病途徑(經(jīng)驗(yàn)q??<0.05 冒晰;圖7?C同衣;表S7STAR方法)壶运。例如耐齐,健康巨噬細(xì)胞中的PRKCB元模塊包含5個(gè)其他風(fēng)險(xiǎn)基因(GPR65ADCY7前弯,PTGER4蚪缀,PTPRCSH2B3),并可通過(guò)循環(huán)AMP(cAMP)信號(hào)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的激活恕出。另外询枚,JAK2UC相關(guān)M樣細(xì)胞中的元模塊包含4個(gè)其他風(fēng)險(xiǎn)基因(CCL20PTGER4浙巫,SH2B3AHR)金蜀,并可能調(diào)節(jié)M樣細(xì)胞中的TNF信號(hào)傳導(dǎo)。

2.16 Single-Cell Expression and Co-expression Help Nominate?Causal Genes across GWAS Loci

單細(xì)胞表達(dá)和共表達(dá)有助于在GWAS基因座上提名因果基因

IBD風(fēng)險(xiǎn)基因的功能一致性表明的畴,單細(xì)胞表達(dá)或共表達(dá)可以幫助查明與多個(gè)候選基因在基因座處締合信號(hào)基礎(chǔ)的基因渊抄。為此,我們確定了20個(gè)IBD和UC風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(每個(gè)區(qū)域都跨越一個(gè)以上的基因)丧裁,其候選基因集包含GWAS牽連的風(fēng)險(xiǎn)基因护桦,我們將其稱為該區(qū)域的“正確”基因(STAR方法)。然后煎娇,對(duì)于每個(gè)這樣的區(qū)域二庵,我們測(cè)試(1)表達(dá),(2)差異表達(dá)或(3)與其他候選基因(在基因座上迭代定義缓呛;STAR方法)共表達(dá)的程度是否可以恢復(fù)“正確”的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)于其中隨機(jī)選擇基因的無(wú)效模型的區(qū)域基因(STAR Methods)催享。無(wú)效模型具有33%的準(zhǔn)確性,當(dāng)我們選擇在任何一種疾病狀態(tài)下具有最大DE系數(shù)的基因時(shí)哟绊,準(zhǔn)確性都不會(huì)提高(圖7?D)因妙。但是,當(dāng)我們選擇在任何細(xì)胞亞群中表達(dá)最高的基因(圖7?D;準(zhǔn)確度55%攀涵,經(jīng)驗(yàn)值p = 0.03)或?qū)儆谄渌蜻x基因的最大模塊(圖7?D铣耘; 63%)時(shí),我們的預(yù)測(cè)會(huì)大大改善以故。準(zhǔn)確度涡拘,經(jīng)驗(yàn)值p = 0.001)。對(duì)于CD基因座据德,沒(méi)有任何方法能明顯優(yōu)于無(wú)效模型(圖7?D)鳄乏,這表明UC和CD的獨(dú)特風(fēng)險(xiǎn)基因在不同位置或僅在患病組織中有活性。

最后棘利,我們使用這種共表達(dá)方法在所有IBD / UC風(fēng)險(xiǎn)基因座中提名了因果基因橱野,其中包括56個(gè)驅(qū)動(dòng)該關(guān)聯(lián)的基因未知的基因(圖7?E;表S7)善玫。我們回收了許多已知的IBD和UC危險(xiǎn)因素(例如HNF4A水援,IFIH1GPR35),但未能識(shí)別其他危險(xiǎn)因素(例如RNF186茅郎;圖7?E)蜗元,突出了我們方法的局限性(討論)。此外系冗,該分析對(duì)53個(gè)不在GWAS涉及的基因中的基因產(chǎn)生了預(yù)測(cè)奕扣,包括RORCITGAVSMURF1圖7?E)掌敬。

Discussion

通過(guò)在臨床環(huán)境中利用scRNA-seq惯豆,我們?cè)u(píng)估了腸道活檢中特定細(xì)胞亞群中的細(xì)胞組成,基因表達(dá)奔害,細(xì)胞間相互作用以及IBD風(fēng)險(xiǎn)基因途徑楷兽。盡管區(qū)分成因和挑戰(zhàn)具有挑戰(zhàn)性,但將單細(xì)胞數(shù)據(jù)與臨床反應(yīng)(例如IAF)华临,細(xì)胞-細(xì)胞相互作用(例如腸上皮細(xì)胞和T細(xì)胞)或風(fēng)險(xiǎn)基因表達(dá)(例如M樣細(xì)胞)相關(guān)可以幫助告知疾病的病因?qū)W芯杀,并突出了治療干預(yù)的新機(jī)會(huì)

M樣細(xì)胞在基線時(shí)很少被檢測(cè)到雅潭,但在炎癥過(guò)程中會(huì)擴(kuò)展并在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)中充當(dāng)樞紐(圖6D; S3A和S3D)揭厚。 這種擴(kuò)張可能反映了第三級(jí)淋巴組織或前哨細(xì)胞(Mabbott等,2013)寻馏。 ?M樣細(xì)胞具有GWAS風(fēng)險(xiǎn)基因的最高表達(dá)(圖7A和7B)棋弥,包括CCL20核偿,其表達(dá)與樣品中Treg細(xì)胞的頻率相關(guān)(表S6)诚欠。他們具有最大的預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)基因模塊(表S7),富含內(nèi)吞作用和Th17分化基因(q <10-3,F(xiàn)isher精確檢驗(yàn))轰绵,這可能反映了抗原的轉(zhuǎn)胞吞作用和傳遞粉寞。

CD8 + IL-17 + T細(xì)胞和Treg從健康組織擴(kuò)張到非發(fā)炎組織(圖2A),并在炎癥過(guò)程中分別成為IL-17(圖4C)和TNF(圖5A左腔,B)的主要來(lái)源唧垦。前者可能有助于T細(xì)胞的致病性和組織損傷(圖4D和4E; 66%共表達(dá)CD4)。 盡管后者可能采取了類似效應(yīng)子的狀態(tài)液样,但與TNF-Treg細(xì)胞相比振亮,它們對(duì)Treg細(xì)胞標(biāo)志物(例如FOXP3,CTLA4和IL10)的富集程度更高(數(shù)據(jù)未顯示)鞭莽。未來(lái)的工作將確定TNF + Treg細(xì)胞是否有助于疾病病理或抗TNF抵抗(Atreya et al坊秸。,2011)澎怒,以及CD8 + T細(xì)胞可塑性在腸道炎癥中的作用褒搔。

OSM信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)未知的髓樣和基質(zhì)細(xì)胞類型參與抗TNF抵抗(West et al。喷面,2017)星瘾。 在這里我們顯示出炎性單核細(xì)胞和IAFs可能分別通過(guò)OSM和OSMR的表達(dá)介導(dǎo)耐藥性(圖5D)。 尤其是惧辈,IAF富含抗TNF無(wú)反應(yīng)者的預(yù)處理樣品(圖5F)琳状。 此外,我們確定OSM表型為TNF盒齿,這可以解釋抗TNF的耐藥性算撮。 未來(lái)的工作將確定IAF是否是藥物反應(yīng)的有力生物標(biāo)志物,或者將抗TNF藥物與抑制IAF細(xì)胞因子和/或受體結(jié)合可以降低UC患者的抗TNF耐藥性县昂。

IAFs獨(dú)特表達(dá)IL11肮柜,這是纖維化的潛在治療靶點(diǎn)(Schafer et al。倒彰,2017)审洞,表明參與了腸纖維化。 因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)了隱窩相關(guān)(WNT2B +)和絨毛相關(guān)(WNT5B +)標(biāo)記(圖1I和S3E)待讳,所以IAF可能反映了不同的成纖維細(xì)胞狀態(tài)芒澜。 ?IAFs表達(dá)了幾種CAF標(biāo)記,并且IAF標(biāo)記在CRC腫瘤中富集(圖5S5B)创淡,表明有共同的起源和/或狀態(tài)痴晦。 癌癥相關(guān)炎癥期間IAF的擴(kuò)張可能會(huì)影響腫瘤的微環(huán)境。 最后琳彩,IAF和炎性單核細(xì)胞均在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)中形成集線器誊酌,并可能影響其他細(xì)胞的比例(圖6E;表S5)部凑。

通過(guò)利用單細(xì)胞共表達(dá),我們將超過(guò)50%的風(fēng)險(xiǎn)基因定位到10個(gè)元模塊上(圖7C)碧浊,并使用這些元模塊在各個(gè)基因座上提名因果風(fēng)險(xiǎn)基因(圖7E)涂邀。但是,這種方法可能無(wú)法識(shí)別低表達(dá)箱锐,在未分析或未與其他風(fēng)險(xiǎn)基因共表達(dá)的細(xì)胞和/或組織中活躍的風(fēng)險(xiǎn)基因比勉。 當(dāng)多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因作用于同一基因座時(shí),它也可能失敗驹止。 但是浩聋,我們發(fā)現(xiàn)即使在對(duì)基因進(jìn)行評(píng)分時(shí),無(wú)論區(qū)域如何(而不是每個(gè)區(qū)域選擇一個(gè)基因)臊恋,它都能改善預(yù)測(cè)結(jié)果(圖S7D; STAR方法)赡勘。 我們希望這些分析將為人類遺傳學(xué)和單細(xì)胞基因組學(xué)的結(jié)合鋪平道路,以便通過(guò)將風(fēng)險(xiǎn)基因模塊與多基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)聯(lián)捞镰,將變體映射到單細(xì)胞表型以及將非編碼變體映射到細(xì)胞來(lái)更好地了解多基因疾病闸与。 單細(xì)胞等位基因特異性表達(dá)和表達(dá)定量性狀基因座(eQTL)分析。

我們的工作為使用scRNA-seq了解人類疾病及其治療反應(yīng)提供了框架岸售。 我們確定與疾病狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞比例和基因表達(dá)的變化践樱,并將其整合以了解細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和藥物敏感性的機(jī)制。 最后凸丸,我們?cè)诟鱾€(gè)基因座上提名風(fēng)險(xiǎn)基因拷邢,預(yù)測(cè)它們的作用細(xì)胞和推定功能,并將它們組裝到構(gòu)成疾病基礎(chǔ)的核心途徑中屎慢。

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  • 我被黑心中介騙來(lái)泰國(guó)打工蛙紫, 沒(méi)想到剛下飛機(jī)就差點(diǎn)兒被人妖公主榨干…… 1. 我叫王不留坞嘀,地道東北人。 一個(gè)月前我還...
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