作者通過整合分析scRNA-seq數(shù)據(jù)肿孵、公開發(fā)表的scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)要销、FACS窜觉、IF和免疫治療的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)撰筷，證實FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞的相互作用參與形成促結(jié)締組織增生性TME陈惰，阻止淋巴細(xì)胞浸潤，可能導(dǎo)致腫瘤免疫治療抵抗毕籽，可以作為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點抬闯。
1. A single-cell transcriptomic atlas of paired human normal mucosa and CRC tissues.
作者對5名非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的腫瘤樣本和鄰近正常組織進(jìn)行了單細(xì)胞測序，經(jīng)質(zhì)控后獲得54103個細(xì)胞关筒，共分為9種細(xì)胞類型溶握。9種細(xì)胞類型在5例患者的腫瘤和癌旁組織中都有，但每種主要細(xì)胞類型的浸潤性程度不同蒸播，可能反映了結(jié)直腸癌進(jìn)展階段的差異睡榆。
2. Characteristics of cell populations in tumor tissues from CRC patients reveals hallmark signatures of TME and prediction of clinical outcome.
Fig 2a：隨后作者探究了這些細(xì)胞亞群相關(guān)調(diào)控通路基因的表達(dá)情況。作者使MsigDB數(shù)據(jù)庫中的hallmark基因集來分析腫瘤組織和鄰近正常組織之間細(xì)胞通路的變化袍榆。結(jié)果顯示與正常組織相比胀屿，腫瘤組織中的免疫相關(guān)途徑，包括炎癥反應(yīng)包雀、IL2/STAT5信號和IL6/JAK/STAT3信號宿崭，不僅在免疫細(xì)胞群（(如髓系細(xì)胞和T/ILC細(xì)胞）中富集，在MSC和ECs在腫瘤組織中也富集馏艾，提示MSCs和ECs也參與抵抗結(jié)直腸癌的免疫反應(yīng)。
與正常樣本相比奴愉，腫瘤的MSC琅摩、ECs和髓系細(xì)胞中缺氧的標(biāo)志基因集更豐富。這些特征可能反映了腫瘤缺氧區(qū)域基質(zhì)細(xì)胞的相互作用锭硼，將巨噬細(xì)胞房资、MSC和ECs連接起來，重塑CRC微環(huán)境檀头。
做法參考分組水平GSVA和批量GSEA和GSVA分析轰异，把熱圖畫成氣泡圖就行了。
由于單細(xì)胞樣本數(shù)有限暑始，作者納入了14個數(shù)據(jù)集搭独，包括TCGA中的 COAD and READ 隊列和GEO中12個獨立的CRC隊列。隨后作者使用CIBERSORT用自己的單細(xì)胞數(shù)據(jù)對這14個數(shù)據(jù)集進(jìn)行了反卷積廊镜。
Fig 2b：反卷積之后作者做了不同細(xì)胞類型比例相關(guān)性牙肝，發(fā)現(xiàn)不同數(shù)據(jù)集中Myeloid cell和MSCs (間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞) 都存在100%的正相關(guān)。
這個思路好哎??
Fig 2c：14個數(shù)據(jù)集的Myeloid cell和MSCs相關(guān)性展示。
Fig 2d：并且作者還發(fā)現(xiàn)MSC浸潤程度較高的CRC患者與較差的overall survival (OS)和progression-free survival (PFS)相關(guān)配椭，髓系細(xì)胞浸潤程度高同樣與較差的OS和PFS相關(guān)虫溜。
3. Tumor-specific FAP+ fibroblasts are associated with colorectal cancer progression.
Fig 3a-c：MSCs和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵基質(zhì)細(xì)胞類型。結(jié)合前面發(fā)現(xiàn)的MSCs與不良預(yù)后相關(guān)股缸，作者對MSC進(jìn)行了亞群細(xì)分衡楞，得到10個亞型。其中FAP+成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中顯著升高敦姻。(FAP是活化成纖維細(xì)胞的marker瘾境，參考CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury)
Fig 3d, e：公共數(shù)據(jù)集也顯示腫瘤樣本的FAP+成纖維細(xì)胞顯著升高，且與較差的PFS相關(guān)替劈。
Fig 3f, g：隨后作者結(jié)合了每個細(xì)胞群的高表達(dá)基因寄雀，使用流式對前面的結(jié)果進(jìn)行了驗證，驗證了腫瘤組織中FAP+成纖維細(xì)胞的顯著升高陨献。
Fig 3h：隨后作者使用velocity探究了FAP+成纖維細(xì)胞的來源盒犹，發(fā)現(xiàn)它主要由FGFR2+ fibroblasts 或 ICAM1+ telocytes分化而來。
Fig 3i-l：隨后作者使用SCENIC對MSCs進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測眨业，發(fā)現(xiàn)FAP+成纖維細(xì)胞主要受TWIST1等的調(diào)控急膀。
Fig 3m：Hif1a通路在FAP+成纖維細(xì)胞中也存在顯著激活。
4. Tumor-specific SPP1+ macrophages are associated with CRC progression.
和Fig3的分析思路一模一樣
作者對髓系細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)分龄捡，得到9種亞型卓嫂。比例變化結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞主要存在于腫瘤組織中，而DC在相鄰正常組織中富集聘殖。
值得注意的是晨雳，SPP1+巨噬細(xì)胞是腫瘤特異性巨噬細(xì)胞，占腫瘤樣本中髓系細(xì)胞的11.6%奸腺，但僅占相鄰正常組織中髓樣細(xì)胞的0.68%餐禁。
TCGA和GSE17536CRC隊列中，SSP1+巨噬細(xì)胞高浸潤患者具有更短的PFS突照。分化軌跡結(jié)果表明腫瘤特異性SPP1+巨噬細(xì)胞可能起源于THBS1+巨噬細(xì)胞帮非。調(diào)節(jié)因子分析結(jié)果表示SPP1+巨噬細(xì)胞主要受到STAT1的調(diào)節(jié)。
此外讹蘑，SPP1+巨噬細(xì)胞也受到HIF-1信號通路的調(diào)節(jié) (Supplementary Fig. 6h, i)末盔。由于FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞都與缺氧誘導(dǎo)的通路密切相關(guān)，作者推測在腫瘤的缺氧區(qū)域可能存在一個基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)座慰，該網(wǎng)絡(luò)將巨噬細(xì)胞和MSC連接起來陨舱，共同促進(jìn)CRC微環(huán)境的惡化。
5. High infiltration of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages correlates with worse patient survival.
Fig 5a：作者利用CIBERSORTx在14個獨立的CRC隊列中分析scRNA-seq鑒定到的58個細(xì)胞類型的浸潤狀態(tài)版仔，結(jié)果驗證FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞相關(guān)性最高隅忿。（和Fig2a的區(qū)別是那個做的是細(xì)胞大群的相關(guān)性心剥，這里做的是所有細(xì)胞亞群的相關(guān)性。）
Fig 5b：在FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞不同浸潤水平的患者中背桐，二者浸潤均較高的患者(FAP+High_SPP1+High)PFS最短优烧，提示這兩種細(xì)胞類型可以協(xié)同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
Fig 5c：與FAP+Low_SPP1+Low相比链峭，F(xiàn)AP+High_SPP1+High樣本顯著富集到內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化畦娄、缺氧、TNF-a和IL-6信號通路弊仪。
Fig 5d-e：腫瘤樣本的FAP和SPP1表達(dá)均增加熙卡。
Fig 5f-h：SPP1和FAP的高表達(dá)均與較差的OS和PFS相關(guān)。
Fig 5i-j：免疫熒光結(jié)果顯示腫瘤組織中FAP和SPP1的表達(dá)均特異性增加励饵。且CRC組織中SPP1陽性和FAP陽性細(xì)胞細(xì)胞在空間上非常接近驳癌，提示二者之間可能存在相互作用。
6. Cell–cell interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages revealed by spatial transcriptomics.
為了得到更多的空間信息役听，作者對五例檢測了單細(xì)胞的患者中的四例的腫瘤組織進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組測序颓鲜。
Fig 6a-c是Patient6的組織，聚類得到10個cluster典予。Fig 6a-c是Patient7的組織甜滨，聚類得到6個cluster (P8和P7一樣是6個cluster)。P9聚類得到8個cluster(Supplementary Fig. 9d–f)瘤袖。
Fig 6a-k：結(jié)果顯示大多數(shù)FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞存在共定位衣摩，并包裹惡性上皮細(xì)胞(i)。
Fig 6l：FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞中促結(jié)締組織增生結(jié)構(gòu)形成的途徑高度活躍捂敌，包括細(xì)胞外基質(zhì)組織艾扮、膠原纖維組織和對TGF-β的反應(yīng)。這些現(xiàn)象表明這兩種類型細(xì)胞之間可能存在物理相互作用占婉，并可能調(diào)節(jié)促結(jié)締組織增生的微環(huán)境以限制免疫細(xì)胞浸潤至腫瘤核心泡嘴。
Fig 6m：T細(xì)胞和B細(xì)胞被排斥在腫瘤區(qū)域以外。
7. FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages interaction may contribute to desmoplastic tumor microenvironment.
為了探究CRC患者中FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞互作時的關(guān)鍵調(diào)控分子锐涯，作者使用NicheNet探究了FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞之間的機(jī)制磕诊。
Fig 7a：作者發(fā)現(xiàn)FAP+成纖維細(xì)胞可以通過COL1A1/LAMA1- ITGB1受體配體對和SPP1+巨噬細(xì)胞相互作用填物。此外纹腌，F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞通過TGF-β超家族基因TGFB1和INHBA的表達(dá)來增強(qiáng)SPP1+巨噬細(xì)胞的促炎活性，TGF-β可以誘導(dǎo)SPP1+巨噬細(xì)胞中ACVRL1滞磺、ACVR1或ACVR1B的表達(dá)升薯。
FAP+成纖維細(xì)胞還可以通過WNTSA-FZD2和CCL3-CCR5互作增強(qiáng)SPP1+巨噬細(xì)胞的招募。此外击困，F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞還可以通過RARRES2-CMKLR1進(jìn)行互作涎劈。
Fig 7b, c：RARRES2在FAP+成纖維細(xì)胞中高表達(dá)广凸，而CMKLR1(編碼chemerin的受體) 在SPP1+巨噬細(xì)胞和THBS1+巨噬細(xì)胞中都存在高表達(dá)。前面velocity的結(jié)果提示THBS1+巨噬細(xì)胞可能是SPP1+巨噬細(xì)胞的來源蛛枚，因此RARRES2-CMKLR1可能驅(qū)動THBS1+巨噬細(xì)胞向SPP1+巨噬細(xì)胞分化谅海。
Fig 7d：CRC患者的chemerin高于正常對照。
Fig 7e-h：NicheNet的結(jié)果顯示蹦浦，SPP1+巨噬細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞因子TGFB1扭吁、IL1A和IL1B，可與FAP+成纖維細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合盲镶，促使多種編碼膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶基因靶點的表達(dá)侥袜。
Fig 7i：對targets的KEGG通路富集結(jié)果顯示這些靶點參與多種促炎和ECM增生通路。
Fig 7j：最后作者構(gòu)建了top3的ligand（TGFB1, IL1B, IL1A）和ECM-related targets的互作網(wǎng)絡(luò)溉贿，發(fā)現(xiàn)了40個下游regulators, 包括HIF1A, AKT1, STAT1 和 NFKB1枫吧。這些靶點是促結(jié)締組織增生反應(yīng)的重要組成部分，其中大部分參與ECM通路宇色。
綜上九杂，F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞形成一個相互作用的網(wǎng)絡(luò)，支持彼此的維持和功能代兵。這兩種細(xì)胞類型可能在ECM重塑中發(fā)揮重要作用尼酿，可能促進(jìn)TME促纖維增生區(qū)的形成。
8. High infiltration of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages correlates with immunotherapy resistance.
最后作者分析了具有不同F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞和/或SPP1+巨噬細(xì)胞浸潤模式的腫瘤的局部免疫特征植影。
結(jié)果顯示FAP+High_SPP1+High的腫瘤樣本表現(xiàn)相對高比例的非同義突變和單核苷酸變異（SNV) 預(yù)測的新生抗原裳擎，并且具有較高的香農(nóng)嫡指數(shù)和TCR豐富度，說明T細(xì)胞對新抗原的無效反應(yīng)思币。
在所有CRC亞型中鹿响，該亞型的淋巴細(xì)胞浸潤最低，表明該特定類型腫瘤的微環(huán)境特征是免疫排斥型的谷饿。
采用IMvigor210公共數(shù)據(jù)集分析預(yù)后相關(guān)性發(fā)現(xiàn)惶我，F(xiàn)AP或SPP1表達(dá)水平高的患者以及FAP和SPP1表達(dá)都高的患者具有更短的OS。相比FAP+Low_SPP1+Low的患者博投，F(xiàn)AP或SPP1High的患者表現(xiàn)出較低的應(yīng)答绸贡，和更多的疾病進(jìn)展(PD)，這表明FAP或SPP1高表達(dá)的患者對抗PD-L1治療的應(yīng)答明顯低于其他患者毅哗。
FAP或SPP1表達(dá)水平高的患者以及FAP和SPP1表達(dá)都高的患者具有更短的OS听怕。相比FAP和SPP1低表達(dá)的患者，F(xiàn)AP或SPP1高表達(dá)的患者表現(xiàn)出較低的應(yīng)答虑绵，和更多的疾病進(jìn)展(PD),SPP1高表達(dá)的患者對抗PD-L1治療的應(yīng)答明顯低于其他患者尿瞭。
模式圖
1.研究團(tuán)隊通過整合分析scRNA-seq數(shù)據(jù)、公開發(fā)表的scRNA-seq和bulkRNA-seq數(shù)據(jù)集翅睛、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)声搁、FACS黑竞、IF和免疫治療的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究提供了單細(xì)胞分辨率下的配對的腫瘤和癌旁正常組織綜合的TME景觀圖疏旨。
2.與癌旁組織相比很魂，結(jié)直腸癌組織特異性富集FAP+fibroblasts及SPP1+macrophages，并通過CIBERSORTx對多個結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞浸潤程度高度相關(guān)檐涝。
3.研究團(tuán)隊進(jìn)一步使用空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)存在同時表達(dá)這兩種細(xì)胞特征基因的聚類莫换，這一聚類的空間位置和細(xì)胞外基質(zhì)的形成高度相關(guān)，提示FAP+fibroblasts和SPP1+macrophages在腸癌中的空間定位上也接近骤铃，并圍繞腫瘤中心形成"墻壁"樣的腫瘤邊界拉岁。
4.最終證實FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞的相互作用參與形成促結(jié)締組織增生性TME，阻止淋巴細(xì)胞浸潤惰爬，可能導(dǎo)致腫瘤免疫治療抵抗喊暖，可以作為CRC治療的潛在靶點。
