單細(xì)胞分析流程之Cell Ranger結(jié)果解讀

各位小伙伴大家好啊奄！

上期我們說(shuō)到了Cell Ranger的下載、安裝以及常規(guī)的使用方法掀潮，這期我們就來(lái)了解讀一下這些結(jié)果吧~

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首先我們了解一下運(yùn)行完Cell Ranger之后菇夸，在哪里可以看到生成的結(jié)果。

還記得我們?cè)谶\(yùn)行Cell Ranger的時(shí)候有個(gè)參數(shù)--id嗎仪吧？--id=XXX庄新，這里的XXX就是最終生成的目錄，該目錄中保存了運(yùn)行過(guò)程中所有的中間文件、日記文件以及最終的結(jié)果择诈。如下圖：

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其中outs目錄中即保存的最終結(jié)果械蹋，也是我們最后需要的。當(dāng)然如果中間出現(xiàn)了報(bào)錯(cuò)吭从，我們也可以通過(guò)查看日志文件朝蜘，例如：_log，查看具體的報(bào)錯(cuò)原因涩金，隨后進(jìn)行修改即可谱醇。

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結(jié)果目錄"outs"

首先我們看一下outs目錄下的文件結(jié)構(gòu)，如下圖：

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這些結(jié)果中主要分成了兩部分：1. 集群中可以使用的結(jié)果（具體的內(nèi)容可以參考上期文章“單細(xì)胞分析流程之Cell Ranger”）步做；2. 網(wǎng)頁(yè)版報(bào)告副渴。

本期的重點(diǎn)是解讀網(wǎng)頁(yè)報(bào)告中的內(nèi)容。

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網(wǎng)頁(yè)報(bào)告"web_summary.html"**

為了快速了解和方便的了解Cell Ranger定量之后的結(jié)果全度，我們首先會(huì)查看html文件煮剧，即web_summary.html，了解初步情況将鸵。如下圖：

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可以看到該網(wǎng)頁(yè)中主要分成了兩部分：Summary和Analysis.

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"Summary"**

1. 異常結(jié)果警告

如果數(shù)據(jù)中存在異常情況勉盅，網(wǎng)頁(yè)的上面會(huì)出現(xiàn)黃色的警告信息。小編這次跑的結(jié)果完全正常顶掉，所以找了一下之前遇到警告信息草娜，如下圖：

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當(dāng)遇到這種報(bào)錯(cuò)情況的時(shí)候我們不要慌，首先看一下是哪些值異常痒筒，對(duì)數(shù)據(jù)有無(wú)影響以及解決辦法宰闰。在Detail部分會(huì)詳細(xì)解釋這個(gè)參數(shù)是什么，以及解決辦法簿透。例如上圖中說(shuō)到在運(yùn)行Cell Ranger的時(shí)候可以調(diào)用--force-cells參數(shù)移袍，小編之前也試過(guò)，這個(gè)參數(shù)的修改需要不斷的嘗試老充，所以也沒(méi)有固定的值??

當(dāng)然如果這些報(bào)錯(cuò)信息并不影響結(jié)果葡盗，我們是可以用這個(gè)結(jié)果繼續(xù)往后分析的～

2. 細(xì)胞和基因數(shù)的統(tǒng)計(jì)

隨后就是查看這次分析中捕獲到的細(xì)胞數(shù)以及基因數(shù)的情況，從這里就能大概知道數(shù)據(jù)的情況蚂维。

小編也做過(guò)好多10X的數(shù)據(jù)戳粒，一般捕獲的細(xì)胞數(shù)都是5,000-10,000，平均的基因數(shù)大概是1,200-15,00虫啥，大家可以看看自己的數(shù)據(jù)是否也在這些范圍內(nèi)蔚约。如果這些值都是在可接受的范圍，那么就可以進(jìn)入下一步的分析啦~

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3. 細(xì)胞的選取

隨后就是細(xì)胞的選取了（也是一個(gè)相當(dāng)重要的圖）涂籽，幫助我們更加直觀的篩選細(xì)胞（如下圖）

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先我們先來(lái)看一下上方的折線圖怎么看：

Y軸是每個(gè)細(xì)胞中UMI的值苹祟，X軸是單個(gè)細(xì)胞的按照UMI大小的排序（降序），所以這個(gè)圖中的曲線是下降的趨勢(shì)。藍(lán)色的線是選取的細(xì)胞（和**2\. 細(xì)胞和基因數(shù)的統(tǒng)計(jì)**中的細(xì)胞數(shù)是一致的）树枫，灰色的線是背景直焙。

正常的數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)會(huì)有兩個(gè)下降的趨勢(shì)（如下圖），第1個(gè)下降的趨勢(shì)：區(qū)分完整細(xì)胞和背景物質(zhì)（因?yàn)榧?xì)胞和其他物質(zhì)相比砂轻，真正細(xì)胞中會(huì)有更多的UMI奔誓，而其他物質(zhì)可能沒(méi)有或者由于一些污染能捕獲到少量的轉(zhuǎn)錄本，所以會(huì)出現(xiàn)第一個(gè)下降的趨勢(shì)）搔涝；第2個(gè)下降的趨勢(shì)：區(qū)分細(xì)胞的質(zhì)量厨喂，捕獲率低或細(xì)胞破碎（這類細(xì)胞中基因數(shù)會(huì)很少，導(dǎo)致UMI數(shù)也少）庄呈，而正常的細(xì)胞中UMI多且分布比較接近蜕煌，所以質(zhì)量好和不好的細(xì)胞在UMI上也會(huì)存在很大的差異，隨后就出現(xiàn)了第2個(gè)下降趨勢(shì)诬留。

當(dāng)數(shù)據(jù)出現(xiàn)了這兩個(gè)下降趨勢(shì)斜纪，且在藍(lán)色區(qū)域的線條比較平穩(wěn)時(shí)，也能說(shuō)明我們的數(shù)據(jù)質(zhì)量好~

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4. 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

繼續(xù)往下走文兑，下一部分是測(cè)序的信息盒刚，包括總的reads數(shù)目以及一些質(zhì)控的指標(biāo)，一般情況下Q30>90%表明質(zhì)量是相當(dāng)不錯(cuò)的绿贞。

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當(dāng)我們看數(shù)據(jù)的時(shí)候伪冰，如果遇到一些指標(biāo)不太明白是什么意思，大家可以點(diǎn)擊左上角的樟蠕？，隨后會(huì)列出下列指標(biāo)的解釋靠柑。

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5. 比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

報(bào)告中除了會(huì)給出測(cè)序信息以外寨辩，也會(huì)給出與基因組的比對(duì)信息，主要包括Genome歼冰、Intergenic靡狞、Intronic、 Exonic隔嫡、Transcriptome甸怕、Antisense to Gene（見下圖）。

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雖然測(cè)序和比對(duì)結(jié)果都是一些常規(guī)的質(zhì)控信息腮恩，當(dāng)我們數(shù)據(jù)一切正常的時(shí)候梢杭，看這些指標(biāo)可能沒(méi)有那么重要，但是一旦我們的數(shù)據(jù)比較奇怪的時(shí)候秸滴，例如發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)還行武契，但是基因數(shù)特別少，這個(gè)時(shí)候測(cè)序和比對(duì)結(jié)果就相當(dāng)重要了！小編之前遇到一個(gè)數(shù)據(jù)就是檢測(cè)到的基因數(shù)特別少咒唆，然后聚類的時(shí)候就結(jié)果很差届垫，后來(lái)就返回去看這些質(zhì)控信息，驚奇的發(fā)現(xiàn)很多reads都是比對(duì)到了基因間區(qū)全释！

所以測(cè)序的reads根本就沒(méi)有落在基因上装处，導(dǎo)致了最終每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的基因非常少，然后再去繼續(xù)往下找原因浸船。

妄迁。所以呀，還是得多看數(shù)據(jù)糟袁，從那以后判族，數(shù)據(jù)下來(lái)小編都會(huì)先看看這些質(zhì)控信息是否正常，才會(huì)繼續(xù)往后做（質(zhì)控也是做科研非常重要的一步呀~）

6. 樣本信息

最后一部分就是樣本信息啦（如下圖）~

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這一部分就是在運(yùn)行Cell Ranger時(shí)候的參數(shù)信息项戴，例如樣本名形帮、Chemistry（運(yùn)行Cell Ranger時(shí)候我們沒(méi)有設(shè)置這個(gè)參數(shù)，那么就默認(rèn)選擇auto：自動(dòng)配置周叮，在報(bào)告中會(huì)給出具體的類型辩撑，這個(gè)就是3' V3版本）、Reference以及Reference路徑等等仿耽。這些信息的給出方便后面查找信息合冀。

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"Analysis"**

****介紹完Summary之后，下面就是Analysis.

1. 分群結(jié)果

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左圖：在TNSE中映射每個(gè)細(xì)胞UMI的值项贺；右圖：TSNE中分群的情況君躺。

Cell Ranger做完定量之后呢，會(huì)默認(rèn)拿已有的結(jié)果跑一下基本的分群开缎，所以在看報(bào)告的時(shí)候我們也可以看一下這里的分群結(jié)果棕叫，心里大概有個(gè)數(shù)~

2. 基因差異表達(dá)分析

Cell Ranger除了做了分群以外，還找了每個(gè)群差異表達(dá)的基因奕删，類似于Seurat中的 "FindAllMarkers"俺泣。

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這里比較好的是，上面Graph-based如果選擇K=2完残，那么這里差異基因列表也會(huì)隨之變動(dòng)伏钠。所以如果覺得Cell Ranger的分群結(jié)果已經(jīng)很符合自己的預(yù)期了，完全可以就用這個(gè)結(jié)果了谨设，而且還可以自己選擇分群的個(gè)數(shù)（直接網(wǎng)頁(yè)挑選熟掂，人性化呀）

3. 飽和度評(píng)估

對(duì) reads 抽樣，計(jì)算不同抽樣條件下檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量占檢測(cè)到的所有轉(zhuǎn)錄本的比例（測(cè)序飽和度)铝宵，如下圖：

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曲線末端接近平滑狀態(tài)說(shuō)明測(cè)序達(dá)到飽和打掘，因?yàn)槔^續(xù)增加測(cè)序量华畏，檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本也不會(huì)有特別大的變化

對(duì) reads 抽樣，計(jì)算不同抽樣條件下檢測(cè)基因數(shù)目的分布尊蚁，如下圖：

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同樣地亡笑，曲線末端接近平滑狀態(tài)說(shuō)明測(cè)序達(dá)到飽和，因?yàn)槔^續(xù)增加測(cè)序量横朋，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的基因數(shù)也不會(huì)有特別大的變化

好啦仑乌，這期就先講到這里，我們下期再見~