這個插件已經(jīng)下架了，上架了更好用的WGCNA shiny：http://www.reibang.com/p/4691c535a522
常見問題反饋和總結(jié)
插件釋放了有差不多一個月了吧，總結(jié)了下大部分同學(xué)反饋回的問題大致分為以下幾種情況：
以后類似問題不做回答炕淮。
先放一下示例數(shù)據(jù) 感謝王瑞老鐵提供京髓。如果用示例數(shù)據(jù)跑出結(jié)果了饭耳，說明插件安裝完成。具體設(shè)置如下圖
提示成功后輸出結(jié)果文件夾下有以下文件說明沒問題了。
- 沒有裝
Rserver插件! 會直接報錯或听，Rserver相對于在TBtools中裝了個R語言，而基于R語言寫的插件運(yùn)行也就是在TBtools的R語言環(huán)境中進(jìn)行Rscript xxx.R如果你連R都沒裝笋婿，怎么可能運(yùn)行起來誉裆？ Rserver插件的獲得方法目前只有CJ在TBtools用戶群中釋放。
-
包安裝的問題： 如果在
test log中發(fā)現(xiàn)報錯信息中包括下面信息的就是包沒有裝成功缸濒，這個大概率是網(wǎng)絡(luò)問題足丢，換個網(wǎng)絡(luò)再運(yùn)行幾次估計就可以了。比如你可以連接你的手機(jī)熱點(diǎn)庇配。反正我連河南移動基本沒問題斩跌。
Error: xxx...package....
there is no package called 'pillar'
count data和trait data有NA值或者空白： 如果你編輯traitdata的時候多打了兩行空白行，或者在某行后面多安了個tab捞慌，都會造成外表上看見你的trait data和count沒有問題耀鸦，實(shí)際上讀近R之后這些空白還是會被讀入data.frame中的，肯定會報錯啸澡，不會擼代碼的話就人肉排查把袖订。把那些亂七八糟的都刪掉...
你想保留的基因數(shù)量超過了過濾后的基因數(shù)量：
如果你仔細(xì)看了下面博客每個參數(shù)詳細(xì)的介紹，這是很好猜到的锻霎，比如你的表達(dá)量矩陣中共有5w個基因(這里忍不住提醒一下著角，建議大家的表達(dá)量矩陣用所有的基因揪漩，不要挑差異基因或者自己選基因做旋恼，具體原因自行查文獻(xiàn)，看WGCNA操作手冊奄容，F(xiàn)AQ冰更，google ) 我寫的流程中會進(jìn)行第一輪篩選，就是下面說的在幾成樣本中fpkm或者readcount大于n昂勒，如果你第一步設(shè)置的閾值太高蜀细，比如九成樣本中FPKM > 100，這樣過濾完以后可能就剩下3000個戈盈，然后在第二步過濾的時候你選擇保留8000個,就會報錯奠衔。這個時候適當(dāng)?shù)臏p少閾值，比如使用readcount的時候用5成樣本中readcount > 10或者5成樣本中FPKM > 1這些塘娶，當(dāng)然這里是可變的归斤，可以自己調(diào)整。最后一種我想罵人刁岸，拜托你們也尊重下作者脏里，好好看看下面的文章！
有幾個老鐵給我郵件說跑不通虹曙，報錯整的我也沒看明白迫横，結(jié)果浪費(fèi)了我好久最后發(fā)現(xiàn)他好幾個參數(shù)都沒有填７摺！矾踱！ 沒有選參數(shù)怎么能跑出來恨狈！所以如果沒有仔細(xì)閱讀下面文章，特別是參數(shù)介紹（腦圖那塊）出現(xiàn)報錯的介返，麻煩您再回去看一遍Ｋ┦隆！圣蝎！
國際慣例先上圖
再放鏈接：
Gitee repo - ShawnMagic / ShawnTBPluginR
寫在前面的一些廢話
剛從北京上完課回所那會刃宵，何老師建議我學(xué)下WGCNA，可能對我可課題有用徘公，當(dāng)時R還沒怎么入門（還逃過一次賴江山老師的課牲证，哈哈）于是就準(zhǔn)備開始鼓搗WGCNA，說實(shí)話关面，那時候?qū)W習(xí)軟件全靠簡書坦袍，知乎，CSDN幾位大佬的教程等太，估計和大多數(shù)朋友一樣捂齐，入門的都是陳同老師的這篇WGCNA分析，簡單全面的最新教程,那時候也沒有看官方文檔的習(xí)慣缩抡，說實(shí)話奠宜，連里面的術(shù)語啥的都不懂，什么加權(quán)共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)瞻想，什么SFT压真，什么KME... 當(dāng)時就想著follow大佬的代碼跑通是正事，后續(xù)Jimmy大佬的一個直播他自己學(xué)習(xí)hope大佬的教程視頻 我是如何學(xué)習(xí)WGCNA分析蘑险，對我啟發(fā)很大滴肿，看文獻(xiàn)，看manual佃迄，試代碼....
我自己比較笨泼差，大概花了半年才逐漸的理解了所有的代碼... 但由于數(shù)學(xué)硬傷，統(tǒng)計呵俏，圖論那一塊真的搞不明白.. WGCNA的原理到現(xiàn)在感覺還是在云霧中堆缘，直接看文獻(xiàn)基本等于在看天書... 可能需要畢業(yè)后靜下心來，好好攻克一下柴信。
之后的事就簡單了套啤，前后做了好多次，隨著潛移默化的發(fā)展，R寫代碼的水平回看起來比之前有了不小的提升潜沦，所以后來把分析切分成了幾個大模塊萄涯，也就形成了今天插件的雛形：
- 數(shù)據(jù)清洗部分
- SFT，power計算唆鸡，樣本聚類
- 一步法網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
- module-trait關(guān)系
后續(xù)的分析基本上就是拿出感興趣的模塊涝影，找hubgene，導(dǎo)出關(guān)系争占，富集分析等等燃逻。那些個性化的操作不想一股腦把所有的模塊都搞出來，主要是占地方臂痕，一下出一串文件大部分也沒有什么卵用伯襟。所以后面會寫新的插件實(shí)現(xiàn)這些功能，根據(jù)前面找出的感興趣的模塊握童，后續(xù)再進(jìn)行分析姆怪。
插件說明
首先說明一個問題，流程化的東西稽揭，多少都會有弊端，所以這個插件只適合粗略的進(jìn)行WGCNA分析肥卡，大致看一下模塊溪掀，trait-module的關(guān)系。因?yàn)閃GCNA分析確實(shí)不是那種一鍵就能搞出非常牛逼的分析結(jié)果... 因?yàn)橛刑嗟膮?shù)需要調(diào)整了步鉴。如果想要真正的做出一個漂亮的WGCNA結(jié)果揪胃。
建議必須閱讀以下文章：
Tutorials for the WGCNA package
WGCNA-FAQ 可以解決你80%的問題
WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis
當(dāng)然還有簡書，知乎各位大佬的文章唠叛，這個就靠你自己去搜索了只嚣。沒有好壞沮稚，各有特點(diǎn)艺沼！
插件代碼主要follow了一下兩位大佬的代碼,如果想快速了解建議閱讀：
WGCNA分析，簡單全面的最新教程
STEP6:WGCNA相關(guān)性分析
使用方法
首先按照CJ大佬的教程安裝Rserver插件這個神級插件是所有基于R的TBtools插件的爸爸??蕴掏，相當(dāng)于在TBtools里面裝了個R障般，
然后在我的Gitee倉庫下載OneStepWGCNA插件這個后續(xù)有更新的話我會及時推送，歡迎各位反饋bug.... 課題組的老鐵給我說了倆..已經(jīng)改正...
和TBtools使用的規(guī)則一致盛杰，拖進(jìn)去挽荡，選參數(shù)，點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)...
首次運(yùn)行時間較長即供，應(yīng)為要裝一堆包定拟，包裝不上大概率是因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)！實(shí)在不行就連熱點(diǎn)逗嫡！
參數(shù)詳解
主要有7個參數(shù)：
-
readcount or fpkm這個文件是表達(dá)量矩陣青自，不能有多于的信息株依，列名（column name）是sample名稱，行名是geneID延窜，中間的數(shù)據(jù)是FPKM值或者readcount 如下表
| GeneID | Sample1 | Sample2 | Sample3 | Sample4 | Sample... |
|---|---|---|---|---|---|
| Gene1 | 1 | 2 | 1 | 2 | ... |
| Gene2 | 0 | 1 | 0 | 2 | ... |
| Gene3 | 2 | 3 | 2 | 1 | ... |
| Gene... | ... | ... | ... | ... | ... |
-
Trait data這里分兩種恋腕，一種是數(shù)量性狀（比如百粒重，株高逆瑞，生育期等這種可以計數(shù)的）還有一種是質(zhì)量性狀（種皮顏色荠藤，有無表皮毛，有無腺體等）获高，或者分類哈肖，第一種數(shù)量性狀表列名為表型，行名為sample name念秧，第二種只有兩列第一列為sample name牡彻，第二列為分類特征。如果既有數(shù)量性狀出爹，又存在質(zhì)量性狀庄吼，建議質(zhì)量性狀的有無用0和1代替（腳本自動處理也是根據(jù)分類生成0-1矩陣）
數(shù)量性狀表
| GeneID | Trait1 | Trait2 | Trait3 | Trait4 | Trait... |
|---|---|---|---|---|---|
| Sample1 | 1 | 2 | 1 | 2 | ... |
| Sample2 | 0 | 1 | 0 | 2 | ... |
| Sample3 | 2 | 3 | 2 | 1 | ... |
| Sample... | ... | ... | ... | ... | ... |
分類表
| Sample | Type |
|---|---|
| Sample1 | case |
| Sample2 | case |
| Sample3 | case |
| Sample4 | control |
| Sample5 | control |
| Sample6 | control |
| Sample... | … |
-
Expression data這里意思是你輸入的表達(dá)量矩陣到底是readcount還是fpkm，readcount是不可以直接用來做WGCNA的严就，需要標(biāo)準(zhǔn)化总寻，根據(jù)官方和Jimmy大佬學(xué)徒的帖子我測試后推薦了兩個選項(xiàng),一個是基于DESeq2的varianceStabilizingTransformation, 另一個是基于edgeR計算的log10(CPM+1)有老鐵反饋lgCPM的結(jié)果不太好，說看看log2(CPM+1)怎么樣,看大家的反饋結(jié)果... 如果用FPKM/RPKM/TPM這類已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的值梢为，這里給了兩個選項(xiàng)渐行，一個是做log另一個是原始的值，這里眾說紛紜铸董，有的說log后把很多差異都抹掉了祟印，還有的說不取log會放大差異...我也是頭疼.. 到底哪種好，我自己感覺你都試試... 能搞到合適的power粟害，構(gòu)建一個真正的scale-free網(wǎng)絡(luò)他就是好方法蕴忆。?? -
RcCuttoff 和 SamplePerc在WGCNA-FAQ中作者提到，最好去除一下noise悲幅，再去做套鹅，（Jimmy大佬也說這不太重要，重要的還是你選多少個基因進(jìn)行WGCNA）官網(wǎng)建議的是保留九成以上樣品中readcount>10的基因汰具，當(dāng)然后面還有強(qiáng)調(diào)就是根據(jù)測序深度卓鹿，自己的生物學(xué)問題而改變。那么這里就給出了兩個參數(shù)RcCutoff： readcount cutoff和SamplePerc：sample percentage,之前我都是基于Readcount做的留荔，所以當(dāng)時取變量名的時候順手就寫成這個了吟孙，估計不會改了，fpkm/RKPM/TPM也是適用的，比如你想5成樣品中fpkm大于0.2那么RcCutoff那里就填0.2杰妓，SamplePerc那里就填0.5肥隆。 -
RemainGeneNum:這個參數(shù)就是你需要保留多少個基因進(jìn)行WGCNA，WGCNA并不是越多越好稚失，當(dāng)然你基因足夠大栋艳，你用的PC也很難全部跑完，對內(nèi)存的要求比較嚴(yán)格句各，跑得多了你會發(fā)現(xiàn)當(dāng)基因數(shù)量到達(dá)一定閾值之后吸占，再增加只會使grey模塊變得更大，因?yàn)樵跊]有樣品異質(zhì)性的RNAseq中凿宾，大部分基因的表達(dá)都是保守的矾屯，意思就是基本在所有樣品中他們的表達(dá)量是一致的。增加再多的也沒有太大用處初厚。這里采取的篩選方法還是魯棒性較強(qiáng)的MAD件蚕，先算MAD，再rank产禾，選取MAD大于0.01的前RemainGeneNum個基因作為WGCNA的input排作。這里有個聯(lián)動各位注意！亚情！ 前面在去噪音的時候會去掉一部分基因妄痪，如果你選擇條件太苛刻，可能會去掉一大半楞件，比如昨天代一個師弟做衫生，他選擇9成的FPKM大于10，7w個基因去的只剩下幾千個...土浸，后面這里又設(shè)置了1w個罪针，所以一炮就報錯。所以一定要注意
結(jié)果文件
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01.test.Sample_clustering 樣品聚類結(jié)果
20210117114017.jpg 這里如果出現(xiàn)明顯的離群樣本黄伊，記住樣本的名字泪酱，在表達(dá)矩陣和trait矩陣中刪掉對應(yīng)樣本再跑一次
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01.test.SFTPlot.pdf 軟閾值篩選
20210117114055.jpg 綠線為0.8 紅線為 0.9，腳本內(nèi)篩選值為0.8
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02.test.Eigeng_adja_heatmap 鄰接基因矩陣熱圖
20210117114126.jpg
反映了模塊相關(guān)性（模塊小于等于3沒法做）
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02.test.Module 模塊劃分
20210117114156.jpg
- 03.test.Module_trait 模塊-矩陣熱圖
- 還有幾個Rdata文件毅舆，是保存了幾個變量西篓，在后續(xù)的WGCNA-module分析插件中有用愈腾，所以現(xiàn)在先保存了一下憋活，倒是后直接load
- test.log保存的日志，腳本運(yùn)行的日志虱黄，如果保存可以查看原因悦即。
- 兩個表格，一個是module-gene對應(yīng)關(guān)系，另一個是所有基因的連通性
最后再嘮叨兩句
做WGCNA最主要的是一定要清楚WGCNA是干什么用的辜梳，第二是你的科學(xué)問題是什么粱甫，常見的困擾大家的問題有幾個我總結(jié)了下：
- 到底是readcount還是fpkm，這里見仁見智作瞄，還是我說的茶宵，你搞出robustness高的scale-free網(wǎng)絡(luò)來是終極目標(biāo)... 沒人去糾結(jié)到底input哪個更科學(xué)，Stack Overflow上有大佬直接用z-score的fpkm也做出來了....所以input方法千變?nèi)f化宗挥，只要有道理就可以乌庶，不可死板教條，要靈活
- 搞不到合適的power.. 這時去查看下你的input契耿，有很多時候大家不清楚WGCNA的作用瞒大，一股腦把所有的表達(dá)量都扔進(jìn)去，沒有合適的power大概率是由于樣品異質(zhì)性（heterogeneous）造成的搪桂，或者換句話說你把不同組織的樣本混合一起跑透敌，其實(shí)在同一物種內(nèi)組織間的差異是要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于品種間的差異的，你這么做如果生物學(xué)問題是想看不同組織間特異表達(dá)的基因模塊沒有問題踢械，如果你想看不同材料間的酗电，建議洗洗睡吧（如果樣本夠建議分開組織各自做）... 所以一定要注意自己關(guān)注的生物學(xué)問題，減少變量内列。
- module-trait相關(guān)性低顾瞻，很好奇文章里姨媽紅是怎么來的。我的經(jīng)驗(yàn)... 如果直接拿數(shù)量性狀關(guān)聯(lián)德绿，大概率會相關(guān)性不高荷荤。我的做法是把數(shù)量性狀分級，整體做個數(shù)據(jù)分布圖移稳，設(shè)置一下bin的大小蕴纳，按bin分級，或者boxplot按照分位數(shù)分級个粱。把數(shù)量性狀轉(zhuǎn)換成等級... 效果確實(shí)會好一點(diǎn)古毛，這個也好理解，如果你做的品種材料間的性狀都许，不是野生型突變體之間稻薇，或者近等基因系之間的，差異不會太顯著胶征，波動范圍很小塞椎，基因的表達(dá)量的波動也很難和你性狀數(shù)值的波動相吻合，但是你分級之后應(yīng)該會變好睛低。只是我個人的經(jīng)驗(yàn)不一定對案狠。
- hubgene怎么搞服傍，目前方法還是眾說紛紜，這部分會在下一個插件中推薦一個更好的方法骂铁，但是吹零！ 一定要注意前提，就是你在前面的分析中得到了一個合適的power拉庵，構(gòu)建了一個scale-free網(wǎng)絡(luò)灿椅，有些分析搞hubgene是沒有意義的，比如強(qiáng)烈樣品異質(zhì)性的WGCNA分析钞支，劃分出module就到頭了阱扬，應(yīng)為你的網(wǎng)絡(luò)很難成為scale-free網(wǎng)絡(luò)，那么hubgene也無從談起了伸辟，你會發(fā)現(xiàn)模塊內(nèi)基因的連通性大部分都在0.9以上... 原因就是你再做WGCNA之前已經(jīng)把模塊劃分好了麻惶，基本上是一個組織對應(yīng)一個模塊...
綜上TBtools牛批，又給我一個裝x的機(jī)會...
