獻給初學者：Q-PCR 計算看這一篇就夠了
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上次看了「一文教你看懂 PCR 結果圖」的童鞋是不是迫不及待得等待后續(xù)的更新呢撤缴？哈哈刹枉，別急，這次我就跟大家詳細介紹 Q-PCR 的計算原理及過程屈呕。絕對干貨哦微宝！
PCR 擴增的速率大家都知道，就是簡單的指數增長虎眨，也就是 1 變 2蟋软，2 變 4，4 變 8 以此擴增嗽桩。數學形式就是 2 的 ct 次方岳守，但是實際過程中的增量應該是（1+e）的 ct 次方，e 是擴增效率也稱擴增系數碌冶。一般我們都假設 e 為 1湿痢。正常的 Q-PCR 我們都會有一個閾值，也就是我們平常說的平臺期种樱。
簡單的說在平臺期的所有基因擴增的數目是一致的蒙袍。而唯一有區(qū)別的則是 ct 值的不同。Ct 值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數 (cycle)嫩挤。所以不難推斷出 ct 值越小害幅，反應擴增到達平臺期所需循環(huán)數越少，目的基因起始含量越高岂昭。下面我們用一個公式進行推導過程：（敲黑板以现，重點！）
PCR 產物量 = 2∧ct * 起始模板量
起始模板量 = PCR 產物量／2∧ct = 起始模板量 * 2∧ - ct
可以得出以下兩個等式：
待檢基因起始模板量 = PCR 產物量 * 2∧ - ct（待檢基因）
內參基因起始模板量 = PCR 產物量 * 2∧ - ct（內參基因）
由于 PCR 產物量是相同的。兩式上下相除得：
待檢基因起始模板量／內參基因起始模板量 = 2∧-【ct（待檢基因）-ct（內參基因）】= 2∧-Δct
上述的算式結果數值只能表示該待檢基因在該處理組中相對于內參的表達量邑遏，沒有任何意義佣赖。想要有看出基因的變化趨勢，則需要與空白處理組的待檢基因起始模板量/內參基因起始模板量進行比較记盒，兩者相除憎蛤，如果比值大于 1，則表明該基因處理后上調纪吮，如果比值小于 1俩檬，則表明該基因處理后表達下調。而兩者相除的結果就是我們經常說的 -ΔΔct碾盟。
明白了原理棚辽，下面我們進行計算（這里以 p53 基因為例進行計算）：
1. 數據的輸出。選擇 Export data（注意一定要選中樣品空后再進行輸出冰肴，不然可能輸出的就是空白樣品）
2. 在這里屈藐，我們需要三組信息，樣品組熙尉，基因組联逻，以及對應的 CT 值組
3. 首先我們按照下列表格進行排列
4. 然后計算每組內參 GAPDH 均值
5. 我們首先計算第一個 Δct，即每組的待檢基因減去內參基因的 CT 值
6. 計算空白組的 Δct 均值
7. 樣品組的 Δct 減去空白組的 Δct 均值骡尽，得到 ΔΔct
8. 計算結果
在這里要說明下實際上的產物量并一定是「2 為底數」而是「（1+e）的 ct 次方」遣妥，只有擴增效率接近于 1 的時候才可以用 2 為底數。關于擴增效率 e 的計算由于篇幅有限下次再解釋哈攀细，有迫切需求的童鞋可以自行網上搜索箫踩，另外本文還提供了可以計算 e 值的相關軟件，LinRegPCR 軟件谭贪。生物學霸后臺回復 「軟件 006」即可境钟。
好了， 看到這大家應該都可以理解如何計算 Q-PCR 數據俭识，并且計算的原理了吧慨削。希望能在科研上對大家有所幫助！
