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CRISPR/Cas9總概
成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats红碑，即CRISPR）II型系統(tǒng)是細菌免疫系統(tǒng)舞吭，現(xiàn)已被改造用于基因工程泡垃。在CRISPR/Cas9廣泛應(yīng)用之前，像鋅指核酸酶（ZFNs）或轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)核酸酶（TALENs）等基因工程技術(shù)羡鸥，都需要使用定制的DNA結(jié)合蛋白核酸酶蔑穴，這需要科學(xué)家為每個基因靶標(biāo)設(shè)計和生產(chǎn)新的核酸酶對(nuclease-pair)。（相比而言惧浴，）CRISPR主要因其簡單性和適應(yīng)性存和，已迅速成為基因工程中最受歡迎的方法之一。
CRISPR包括兩個部分：一個向?qū)NA(gRNA)和一個非特異性CRISPR結(jié)合核酸內(nèi)切酶(CRISPR-associated endonumclease即Cas9)衷旅。向?qū)NA是一個短的合成RNA,由一段結(jié)合Cas9必需的scaffold序列和特定的約20nt的空載(spacer)或靶向(targeting)序列（靶位點）組成捐腿，其中靶向序列決定了用于修飾的基因靶標(biāo)。因此我們只需改變gRNA上的靶向序列即可改變Cas9的基因靶標(biāo)柿顶。CRISPR最初用于敲除各種細胞類型或生物體的靶向基因茄袖，但對Cas9酶的改造已經(jīng)將CRISPR的應(yīng)用擴展到選擇性激活或抑制靶向基因或純化特定的DNA區(qū)域，甚至可以和熒光顯微結(jié)合用于展現(xiàn)活細胞中的DNA嘁锯。而且宪祥，產(chǎn)生gRNAs的便捷促使CRISPR成為了最具擴展性的基因編輯技術(shù)之一聂薪，近來已被應(yīng)用于基因組水平的篩查。
這篇指南將提供CRISPR/Cas9生物學(xué)方面的概覽蝗羊，介紹CRISPR的不同應(yīng)用藏澳，幫助諸位在各自領(lǐng)域上開展CRISPR/Cas9的研究。
使用CRISPR/Cas9進行敲除
通過靶向基因特異的gRNA和核酸內(nèi)切酶Cas9的共表達耀找，CRSIPR/Cas9可用于產(chǎn)生敲除細胞或敲除動物翔悠。** 基因靶位點可以是任何滿足以下兩點條件的約20nt的DNA序列：**
- 該序列在基因組中是特異存在的。
- 靶位點緊鄰著PAM（Protospacer Adjacent Motif）區(qū)并位于PAM區(qū)上游野芒。
PAM序列是結(jié)合靶標(biāo)必不可少的凉驻，具體序列取決于Cas9的種類（釀膿鏈球菌Cas9 5’NGG3’）。我們將關(guān)注釀膿鏈球菌Cas9复罐，因其目前廣泛使用于基因工程涝登。一旦表達，Cas9蛋白和gRNA將形成一個核糖體蛋白復(fù)合物效诅，這個復(fù)合物是通過gRNA的scaffold區(qū)域和Cas9上表面暴露帶正電荷的溝糟相互作用形成的胀滚。Cas9與gRNA的結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生了改變，分子由無活性的非DNA結(jié)合構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腄NA結(jié)合構(gòu)象乱投。更重要的是gRNA上的靶位點序列仍未和靶標(biāo)DNA發(fā)生相互作用咽笼。Cas9-gRNA復(fù)合體將任意地結(jié)合基因組上的PAM序列，但是只有g(shù)RNA靶位點序列與靶標(biāo)DNA配對時戚炫，Cas9才能進行切割（這段靶標(biāo)DNA）剑刑。一旦Cas9-gRNA復(fù)合物結(jié)合到一段認定的DNA靶標(biāo)，在gRNA靶向序列3’端的“種子”序列開始使靶標(biāo)DNA退火双肤。如果種子序列與靶標(biāo)DNA序列配對施掏，gRNA將持續(xù)的沿3’到5’端方向使靶標(biāo)DNA退火。
只有當(dāng)gRNA靶位點序列與靶基因有足夠的同源性存在時茅糜，Cas9才會作用切割靶基因七芭。拉鏈?zhǔn)降耐嘶饳C制可能解釋了為什么靶標(biāo)上3’端種子序列上的錯配會完全破壞對靶標(biāo)的切割，而5’端的錯配有可能會對靶標(biāo)進行切割蔑赘。Cas9核酸酶有兩個功能性內(nèi)切酶區(qū)：RuvC和HNH狸驳。當(dāng)Cas9與靶基因位點結(jié)合時發(fā)生了第二次構(gòu)象變化，核酸酶功能區(qū)對靶標(biāo)DNA的反向鏈進行定位切割。Cas9介導(dǎo)的DNA切割最后結(jié)果是目標(biāo)DNA（PAM序列上游約3～4nt）的雙鏈斷裂（double strand break，DSB）聂受。
雙鏈斷裂后由以下兩種常規(guī)的修復(fù)途徑進行修復(fù)：
- 有效但易錯的非同源末端連接途徑(NHEJ)
- 低效但高保真的同源性修復(fù)途徑(HDR)
NHEJ修復(fù)途徑是最活躍的修復(fù)機制，能快速的修復(fù)雙鏈斷裂辩昆，但通常會在雙鏈斷裂位點產(chǎn)生小的插入缺失。NHEJ介導(dǎo)的雙鏈斷裂修復(fù)的隨機性具有重要的實用意義物喷，因為Cas9和gRNA在細胞群體中的表達卤材，將產(chǎn)生多種不同的突變遮斥。大多數(shù)情況下，NHEJ引起的靶標(biāo)DNA上的小InDels扇丛，會導(dǎo)致閱讀框內(nèi)的氨基酸插入缺失术吗，或者移碼突變引起的目標(biāo)基因上ORF提前終止。理想情況下帆精，在靶標(biāo)基因內(nèi)形成功能缺失性的突變较屿。然而，對特定的突變細胞表型的敲除能力最終取決于殘存的基因功能的劑量卓练。
用Cas9的切口酶提高特異性
當(dāng)gRNAs設(shè)計準(zhǔn)確時隘蝎，CRISPR/Cas9具有很高的特異性，但是特異性依然是一個主要的關(guān)注點襟企，特別是當(dāng)CRISPR應(yīng)用于臨床時嘱么。CRISPR系統(tǒng)的特異性主要取決于gRNA靶向序列特異性如何，即基因靶標(biāo)相比于基因組其余部分的情況顽悼。理想狀態(tài)下曼振，gRNA靶向序列與靶標(biāo)DNA具有高度同源，而與基因組上其它位置沒有同源性蔚龙。（但）現(xiàn)實是冰评，在基因組上，會有另外的位點與指定的gRNA靶向序列部分同源木羹。這些位點被稱為“脫靶”甲雅，你在設(shè)計gRNA時需要考慮到這些位點。
為了優(yōu)化gRNA的設(shè)計坑填，CRISPR的特異性可以通過改造Cas9自身來得到提升抛人。如先前討論那樣，Cas9通過兩個核酸酶功能區(qū)域穷遂，RuvC和HNH函匕，的結(jié)合活性來形成雙鏈斷裂。每個核酸酶結(jié)構(gòu)域上精確的氨基酸殘基是已知的蚪黑，這些殘基序列對內(nèi)切酶的活性至關(guān)重要（在釀膿鏈球菌Cas9中D10A對HNH和H840A對RuvC），Cas9酶的修正版已生成中剩，它僅包含一個催化活性功能域(稱為“Cas9 nickase”)忌穿。Cas9切口酶依然基于gRNA的特異性來結(jié)合DNA,但切口酶僅能切開DNA的一條鏈，形成一個切口“nick”,或使單鏈斷開结啼，而不是雙鏈斷裂掠剑。使用完好的互補鏈作為模板，DNA上的切口迅速地被HDR途徑（同源性修復(fù)途徑）修復(fù)郊愧。因此需要使用兩個切口酶來切割靶標(biāo)DNA的兩條鏈以形成雙鏈斷裂（這種通常被稱為“double nick”或者“dual nickase”CRISPR系統(tǒng)）朴译。這種需求迅猛地增加了靶特異性井佑，因為這和在足夠近的范圍內(nèi)雙鏈斷裂產(chǎn)生的兩個脫靶的nicks的方式截然不同。因此眠寿，如果特異性或者減少脫靶的影響是考慮的關(guān)鍵因素躬翁，那么就采用雙切口酶方法來產(chǎn)生兩個nick引起的雙鏈斷裂。為了獲得高特異性的基因編輯盯拱，切口酶系統(tǒng)也可以聯(lián)合HDR（同源性修復(fù)途徑）介導(dǎo)的基因編輯一起使用盒发。
使用HDR進行精確的改造
NHEJ介導(dǎo)的雙鏈斷裂修復(fù)不夠完美，通常會導(dǎo)致基因ORF閱讀框的中斷狡逢，HDR能用于產(chǎn)生特異性的核苷酸改變（這也是人們所說的基因“編輯”）宁舰，這種改變小到單核苷酸改變大到大片段插入（例如，添加一個熒光基團或者tag）奢浑。
為了利用HDR進行基因編輯蛮艰，一段DNA”修復(fù)模板”序列需要和gRNA+Cas9蛋白／Cas9n蛋白一同轉(zhuǎn)入研究者感興趣的細胞中。修復(fù)模板必須包含所需編輯位點以及緊鄰靶標(biāo)的上下游同源序列（稱作左右同源臂）雀彼。每條同源臂的長度以及結(jié)合位點取決于想要進行的改變的大小印荔。修復(fù)模板可以是一個單鏈寡核苷酸/雙鏈寡核苷酸/雙鏈DNA質(zhì)粒，這因不同的應(yīng)用而不同详羡。值得一提的是仍律，修復(fù)模板在基因組DNA不能帶有PAM序列，否則修復(fù)模板將成為Cas9切割的合適目標(biāo)实柠。例如水泉，PAM序列可以進行突變處理，以至于不再出現(xiàn)窒盐，但是基因編碼區(qū)不受影響（也即草则，沉默突變）
即使在表達Cas9、gRNA和外源性修復(fù)模板的細胞中蟹漓，HDR效率通常也比較低（低于修飾等位基因的10%）炕横。因此，一些實驗室人為地嘗試加強HDR葡粒，有的是在HDR起作用時同步化細胞周期份殿，有的是通過化學(xué)的或遺傳學(xué)的抑制基因來參與NHEJ。HDR的低效性有許多重要的實用意義嗽交。首先卿嘲，因為Cas9的切割效率相對較高，而HDR效率相對較低夫壁，一部分Cas9引導(dǎo)的雙鏈斷裂被NHEJ修復(fù)拾枣。也就是說，最后細胞群體中會包含一些野生型等位基因，NHEJ修復(fù)的等位基因梅肤，和/或一些所需的HDR編輯等位基因司蔬。因此，需要通過實驗來驗證所需的編輯是否存在姨蝴，如必要的話俊啼，對所需編輯的克隆進行分離。
