1128 轉(zhuǎn)錄組分析 B站up主天馬行空的坦克兵 （講解清晰易懂）

09 ?刪除conda下的某一款軟件 刪除名為rnaseq1環(huán)境下的比對軟件STAR：remove -n rnaseq STAR ?????????Ctrl+C停止運(yùn)行程序 ?（刪前刪后注意查看，查看有兩種，去所屬環(huán)境刪除與直接指定環(huán)境用命令刪除）

刪除名為rnaseq1環(huán)境下所有軟件： remove -n rnaseq --all

?

10 ?安裝mamba - conda的左右手

conda網(wǎng)站上搜索mamba缴挖，第一條（下載量最多）匹配出來的mamba，點(diǎn)進(jìn)去忆嗜，根據(jù)命令安裝。

mamba是所有環(huán)境都可能會(huì)用到的軟件崎岂，并且對整體環(huán)境無干擾捆毫，所以安裝在base環(huán)境。

由于mamba基于conda而產(chǎn)生的冲甘，所以使用時(shí)必須是在conda激活的環(huán)境下绩卤。

mamba安裝其他軟件報(bào)錯(cuò)命令：不能打開下載文件，沒有這個(gè)文件夾或者路徑Couldn’t open fiel for download ...（可能是版本不匹配江醇，直接粘貼Github反饋網(wǎng)址濒憋，進(jìn)入看看Mamba軟件更新情況，小姐姐安裝了0.9.1版本（降了版本型號陶夜，結(jié)果還是不行））

11mamba安裝軟件報(bào)錯(cuò)&conda 安裝軟件卻不報(bào)錯(cuò)（中）

為什么我的which STAR凛驮，不顯示STAR軟件的所在路徑呢？但我的STAR --help能夠找到.（注意軟件名大小寫的區(qū)別条辟，在安裝時(shí)黔夭，大小寫仿佛沒有區(qū)別。但是在搜索查詢時(shí)捂贿，大小寫要注意區(qū)分纠修。)

安裝時(shí)可以用bioconda.org官網(wǎng)查詢匹配。

11mamba安裝軟件報(bào)錯(cuò)&conda 安裝軟件卻不報(bào)錯(cuò)（下）

作者嘗試厂僧，退出rnaseq環(huán)境，進(jìn)入base環(huán)境了牛，新建一個(gè)環(huán)境颜屠，將mamba安裝在新環(huán)境下辰妙。激活新環(huán)境（換環(huán)境嘗試，報(bào)錯(cuò)依舊）

刪除環(huán)境時(shí)甫窟，必須注意要退出該環(huán)境密浑，再進(jìn)行刪。

mamba安裝再base環(huán)境下粗井，先退出base尔破，再remove -n base mamba(刪除名為base環(huán)境的mamba軟件)

再次嘗試（無效）：解壓mamba文件 tar zxvf mamba.gz ./ (無效)，拷貝cp app ~/miniconda3 -r浇衬； 移動(dòng)當(dāng)前文件夾所有文件到上一級文件夾下 mv ./* ../ -r （有空的文件夾懒构，不能拷貝）

?

11 mamba安裝軟件成功案例（最終）---結(jié)果作者還是報(bào)錯(cuò)了 ，報(bào)錯(cuò)命令conda has prepared the above report

?

12conda或者mamba安裝軟件經(jīng)典報(bào)錯(cuò) HTP000 CONECTION FAILED,HTTP error(經(jīng)典網(wǎng)絡(luò)不行的報(bào)錯(cuò))

?

13conda安裝軟件報(bào)錯(cuò) An unexpected error has occured, conda has prepared the above report. 可能安裝的軟件與python版本不匹配耘擂，最好改變安裝軟件的版本胆剧，因?yàn)閜ython包（Python包是基礎(chǔ)配置包）一變，可能會(huì)導(dǎo)致其他版本不能用醉冤。中等新建新環(huán)境秩霍，安裝匹配的python版本（麻煩，得反復(fù)調(diào)用）蚁阳，最次直接在原環(huán)境直接更改python版本铃绒。

查看版本conda list或 ?軟件名 -V。

?

[if !supportLists]14.?[endif]conda 安裝的兩個(gè)軟件是“歡喜冤家”不能共存螺捐，其實(shí)就是版本沒找對（更新或者降低版本）（版本號要相互對應(yīng)颠悬，要先安裝一個(gè)包，再按另一個(gè)包归粉，才能使用）

那怎么找是否兼容（依存）呢椿疗，怎么安裝呢

怎么找對版本：去官網(wǎng)查看有無depend（依存）關(guān)系；此外可以運(yùn)用mamba repoquery denpends 包名 命令去查詢依賴關(guān)系（誰依賴mamba） mamba repoquery whoneeds python(誰需要某某軟件)

怎么安裝：---技能三：利用conda安裝最新版本mira和mitbom （參考博主此個(gè)視頻糠悼，能夠解決不兼容問題届榄。）

15借助conda軟件安裝報(bào)錯(cuò)，出現(xiàn)GLIBCXX_3.4.22 not found問題（安裝上了倔喂，為啥查找不到）---軟件庫新建鏈接就行（見up主铝条，fastp軟件系列2與3，解決這個(gè)問題）

（命名安裝不了席噩，彈不出幫助文檔）-----（可能是軟件名大小寫問題）班缰，想要弄清大小寫，去萬能的官網(wǎng)搜 anaconda.org/search（但是注意官網(wǎng)與服務(wù)器大小寫不統(tǒng)一悼枢，如star埠忘，官網(wǎng)小寫，但是在服務(wù)器是大寫的；此外注意服務(wù)器中每個(gè)字母莹妒，每個(gè)空格都有特定的意義名船，不能大意）

小思考：(可以考慮做一款推薦版的視頻，每個(gè)軟件應(yīng)該安裝什么版本旨怠，安裝的順序----這種效果應(yīng)該會(huì)非常不錯(cuò)--自己會(huì)了之后做這個(gè)---up主在第16節(jié)就進(jìn)行了推薦渠驼，安裝的話可以借鑒他們實(shí)驗(yàn)室的流程)

16轉(zhuǎn)錄組分析—總結(jié)自己Linux上常用的轉(zhuǎn)錄組版本軟件

安裝的時(shí)候，名稱用trim-galore鉴腻，查詢的時(shí)候迷扇，軟件名稱是用trim_galore

可以強(qiáng)烈借鑒作者的各種軟件版本。那樣不會(huì)存在版本問題爽哎。

17批量下載ebi中的fastaq/SRA數(shù)據(jù)

準(zhǔn)備數(shù)據(jù):GSE155902(自身必須根據(jù)作者的路程演示一遍***,跟著up主做一遍蜓席，可以思考不斷的做PPT進(jìn)行輸出)

（選擇原因：該組數(shù)據(jù)分組明確，樣本量較少倦青，便與演示瓮床，文章中清晰展示過程，并給出了原始數(shù)據(jù)----可以自己演示進(jìn)行比較）

掛在后臺(tái)下載NCBI中的數(shù)據(jù)

nohupwget -c 鏈接 &（）368302是其名稱

下載位置：批量下載的話可能下載在家目錄下的NCBI處

Kill 368302（結(jié)束進(jìn)程）

取消下載則先刪除文件rm SRR12415656 ,接著取消后臺(tái)下載rm nohup.out

Sra的格式需要用個(gè)軟件轉(zhuǎn)換成FASTAQ格式产镐，不如利用EBI網(wǎng)站搜索轉(zhuǎn)換隘庄，直接下載FASTAQ格式

批量下載（基于文件命名有順序，所以利用for循環(huán)指定范圍進(jìn)行批量下載）】

for循環(huán)展示：for i in {1..100} ?（展示1-100癣亚，并用空格隔開）

> do echo -ne “$i ”(-ne數(shù)字與數(shù)字之間以空格隔開)

> done

批量下載命令：

如for i in 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 ?; do

>{

> nohup wget -c ftp: //ftp.sra.ebi.ac.uk/voll/fastq/SRR124/0${i}/SRR124156${I}/SRR124156${i}_1.fa stq.gz &

>}

>done

Ctrl+P鍵可以顯示之前輸入的命令丑掺，Ctrl+N鍵可以顯示下一個(gè)常用命令； tail -f nohup .out（可以查看下載進(jìn)度）

18 解讀轉(zhuǎn)錄組測序下機(jī)數(shù)據(jù)&fastaq文件述雾，到手的下機(jī)數(shù)據(jù)街州、利用linux查看fasta文件

一查看什么（測序信息）

查看每個(gè)下載數(shù)據(jù)內(nèi)部內(nèi)容，每一行代表什么

zless SRR12415652_1. fasta.gz |head -n 8(只查看該數(shù)據(jù)集的前8行玻孟，up主打算精心講解其組成)

ATCG表示通過紅黃藍(lán)綠熒光進(jìn)行修飾的唆缴，N代表沒有讀出熒光顏色，不知道堿基組成黍翎。

zless SRR12415652_1. fasta.g 不用管道部分（想看多少看多少）

數(shù)據(jù)集的內(nèi)容組成由4行4行的循環(huán)格式組成面徽，每一個(gè)4行代表

4行中第一行代表的是測序信息（啥樣本（樣本名稱）啥儀器啥泳道啥流動(dòng)池啥line啥tiel，啥X/Y匣掸，最末尾的1代表第一個(gè)reads）

行中第二行代表的是堿基順序（如果含N太多的話趟紊，需要質(zhì)控修建掉吧）

第三行代表的是+號（一般沒有內(nèi)容，有內(nèi)容也基本與第一行一樣碰酝，但是+號必須保留）

第四行代表（第二行每一個(gè)堿基的質(zhì)量值霎匈，代表相對應(yīng)堿基的ASC‖碼）ASC‖碼有phred33與phred64碼，目前主要是用phred33送爸，反映堿基質(zhì)量铛嘱。

?

19 解讀轉(zhuǎn)錄組測序下機(jī)數(shù)據(jù)&fastaq文件（同18）

20轉(zhuǎn)錄組分析——怎么才能知道下載的fastq文件是否完整--md5sum（校驗(yàn)碼）文件輕松搞定

用md5sum *gz >md5.txt（將當(dāng)前位置所有md5sum *gz文件寫入md5.txt文件暖释，目錄下會(huì)多一個(gè)md5.txt文件，可以用md5查看文件完整性）---- cat md5.txt（可以比對公司的或者網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫提供的弄痹，確認(rèn)數(shù)據(jù)是否被改動(dòng)或者有缺失） ?md5sum -c md5.txt（可以用于反饋下載數(shù)據(jù)是否完整）

21轉(zhuǎn)錄組分析 ?---對GSE155902批量fastQC質(zhì)控

檢查完數(shù)據(jù)完整性之后饭入，進(jìn)行質(zhì)控嵌器，質(zhì)控利用fastQC軟件肛真，一般都是批量進(jìn)行質(zhì)控

查看當(dāng)前文件夾下有多少格文件ls |wc -l

[if !supportLists]一、[endif]先展示單個(gè)進(jìn)行質(zhì)控

激活安裝軟件的小環(huán)境conda activate fastQC

接著開始質(zhì)控fastqc -t 2 SRR12415652_1.fastq.gz(-t 2代表的是兩個(gè)線程爽航，跑的可能稍微慢些)

ls質(zhì)控之后蚓让，會(huì)生成一個(gè)SRR12415652_1.fastq.html（網(wǎng)頁），可以下載該網(wǎng)頁進(jìn)行查看讥珍，每次質(zhì)控历极，都會(huì)生成一個(gè)zip

二、批量質(zhì)控

用通配符ls *gz |xargs fastqc -t 5

避免一個(gè)一個(gè)點(diǎn)開相應(yīng)的html進(jìn)行查看（上百個(gè)不得點(diǎn)死衷佃，所以multiqc來了）趟卸，可以將各自的html打包成一個(gè)html總文件進(jìn)行查看

用multiqc ./（直接匯總生成multiqc的html）

可以下載到桌面進(jìn)行查看，也可以用軟件進(jìn)行查看氏义。

22轉(zhuǎn)錄組分析---對GSE155902批量trim_galore質(zhì)量控制

創(chuàng)建一個(gè)名為rawdata_qc的文件mkdir rawdata_qc

將所有html锄列、zip文件都放在該文件夾下mv *html ./rawdata_qc

mv *zip ./rawdata_qc/

mv multiqc_data/ ./rawdata_qc/

創(chuàng)建一個(gè)文件rawdata

把所有g(shù)z結(jié)尾文件放入該文件夾下 mv *gz ./rawdata

ls

cd rawdata

用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控（所有相應(yīng)操作必須要有相應(yīng)軟件---trim_galore安裝之前，必須先安裝cutadapt）

批量進(jìn)行處理（原始數(shù)據(jù)質(zhì)控處理）

用ls *_1.*gz>1 ?（把1結(jié)尾的文件寫成1結(jié)尾的文本文件）

用ls *_2.*gz>1 ?（把2結(jié)尾的文件寫成2結(jié)尾的文本文件）

paste 1 2 > config ??(把1與2并排排列惯悠，整理在一個(gè)文件夾下)

Mkdir cleandata cleandata_qc（建立cleandata文件與其質(zhì)控文件）

用dir=”./cleandata”(指定輸出路徑)

用cat config |while read id ??????????????(讀取列表)

do

arr=${id}

fq1=${arr[0]}

fq2=${arr[1]}

nohup trim_galore -q 25 --phred33邻邮、64

23 轉(zhuǎn)錄組分析錄屏 ---對trim_galore質(zhì)控后的fastq文件fastqc一下，看一下質(zhì)控效果

進(jìn)入質(zhì)控完的結(jié)果的目錄下

cd cleandata后將cleandata_qc放在cleandata下（原始文件gz結(jié)尾克婶，質(zhì)控文件fq.gz結(jié)尾）

測序長度筒严，由于后續(xù)重復(fù)較高，設(shè)置為20-100情萤，20太低了鸭蛙，所以up主將其調(diào)為

質(zhì)控效果不好，所以作者打算重新進(jìn)行質(zhì)控

?

找?guī)灼恼驴纯崔D(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果怎么閱讀筋岛？明白fastqc與multiqc處理之后娶视，結(jié)果的閱讀方式。

24 轉(zhuǎn)錄組分析——trim_galore軟件的使用方法（講解質(zhì)控文件trim_galore的幫助文檔）

[if !supportLists]1-?[endif]conda avcivate rnaseq

[if !supportLists]2-?[endif]trim_galore(想用必須安裝cutadapt)

[if !supportLists]3-?[endif]trim_galore利用trim_galore --help查看該軟件的使用說明泉蝌，-q（保證每一個(gè)堿基的之質(zhì)量歇万，默認(rèn)是20，up主一般用25）勋陪； -phred33 （sanger測序1.9的話就是ASC‖+33贪磺，其余則是64（普遍是33型）； --fastqc （運(yùn)行FastQC诅愚，產(chǎn)生FastQC文件）寒锚； 實(shí)在不行可以運(yùn)用百度搜索例子劫映。--stringency（接頭序列重復(fù)不能超過一個(gè).?不大理解該含義） -e(錯(cuò)誤率設(shè)置為0.1) ?--length（長度默認(rèn)20，太短的話比對序列會(huì)顯著增加） ?--max n （最多允許幾個(gè)n出現(xiàn)） ?--trim-n（去除n堿基）

[if !supportLists]4-?[endif]trim_galore -l 25 -stringency 3 -q 25 --phread 33（堿基長度設(shè)置為25刹前，接頭重復(fù)不能超過3否則會(huì)被刪除泳赋，堿基質(zhì)量值要大于25， ASC‖堿基質(zhì)量評估類型） ?需要什么參數(shù)喇喉，按照help文檔進(jìn)行添加即可祖今。

哎，作者又?jǐn)嗔思鸺迹懔饲埽炎髡呦鄳?yīng)的技能視頻也先學(xué)了把歪沃。