影響因子：11

研究概述：腦海綿狀血管畸形（CCMs）是一種常見的神經(jīng)血管畸形棘捣，可以以散發(fā)或家族形式出現(xiàn)在年輕成年人中。這些畸形的特點是靜脈毛細血管床的血管異常擴張，沒有間隔的腦實質(zhì)乍恐。這種畸形的血流速度慢评疗，容易形成血栓∫鹆遥患者終生面臨中風(fēng)百匆、癲癇和局灶性神經(jīng)功能缺損的風(fēng)險，目前尚無有效的藥物治療呜投。到目前為止加匈，盡管發(fā)現(xiàn)了與血管生成、血管生成和血管重塑相關(guān)的基因和遺傳風(fēng)險因素仑荐，但CCMs的精確發(fā)病機制尚不清楚雕拼，治療方法也未確定。銅死亡（cuproptosis）是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡形式粘招，與線粒體代謝有關(guān)啥寇，顯著不同于已知的細胞死亡形式如凋亡、鐵死亡和壞死洒扎。研究表明辑甜，銅死亡依賴于線粒體呼吸，由細胞內(nèi)銅的缺乏或過量引發(fā)袍冷。細胞內(nèi)銅過量可轉(zhuǎn)運至線粒體磷醋，與三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）中的脂肪酰化成分直接結(jié)合胡诗，導(dǎo)致蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激并最終導(dǎo)致細胞死亡邓线。基于全基因組CRISPR-Cas9篩選乃戈，已鑒定出多種與銅死亡相關(guān)的基因（CRGs）褂痰。本研究旨在通過綜合方法探討銅死亡在CCMs進展中的潛在作用，分析不同CCMs亞型中CRGs的貢獻症虑，篩選與銅死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因缩歪，并在外部數(shù)據(jù)集和本研究中的CCM樣本中驗證這些基因。此外谍憔，研究還探討了這些關(guān)鍵基因與CCMs免疫微環(huán)境之間的相互作用匪蝙，提供了免疫調(diào)節(jié)在疾病進程中的新見解。這些結(jié)果可能為了解CCMs發(fā)展的多樣性和復(fù)雜機制提供寶貴的見解习贫，并為潛在的治療策略鋪平道路逛球。具體流程如下：

本文生信部分本質(zhì)上是通過分型進行分組，對比不同組的各種差異苫昌，然后進行評分颤绕，比較分數(shù)與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系。

研究結(jié)果：

CCMs和對照組中的銅死亡相關(guān)的基因CRGs表達

作者分析了從21名患者獲得的兩個GEO表達譜數(shù)據(jù)，其中對照組6名奥务，CCMs組15名（圖2A）物独。作者發(fā)現(xiàn)CCMs組和對照組之間共有2963個差異表達基因（DEGs），其中1169個基因在CCMs中上調(diào)氯葬，1794個基因下調(diào)（圖2B）挡篓。隨后進行的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的基因主要富集在與免疫和血管生成相關(guān)的通路中（圖2C）帚称。為了進一步研究CRGs在CCMs中的表達模式官研，作者探究了銅死亡基因在其中扮演的作用。研究結(jié)果表明闯睹，四個銅死亡基因（CDKN2A, GLS, PDHA1, 和 PDHB）在對照組和CCMs組之間存在顯著表達差異（圖2D-F）戏羽。其中，CDKN2A在CCMs中高表達瞻坝，而GLS, PDHA1, 和 PDHB在對照組中高表達蛛壳。此外， CRGs的相關(guān)性分析結(jié)果顯示所刀，F(xiàn)DX1與CDKN2A和DLD呈正相關(guān)衙荐，而GLS與CDKN2A和FDX1呈負相關(guān)（圖2G）。隨后作者采用CIBERSORT算法評估了樣本的免疫浸潤情況浮创。分析結(jié)果表明忧吟，與對照組相比，CCMs中存在顯著的免疫細胞浸潤斩披，包括巨噬細胞溜族、樹突狀細胞、B細胞和T細胞（圖2H）垦沉。進一步分析CRGs與免疫細胞的關(guān)系顯示煌抒，大多數(shù)CRGs與趨化因子受體、T細胞厕倍、抗原提呈細胞寡壮、樹突狀細胞和濾泡輔助性T細胞呈正相關(guān)，而與APC共抑制讹弯、旁炎癥况既、調(diào)節(jié)性T細胞、I型干擾素反應(yīng)组民、腫瘤浸潤淋巴細胞棒仍、人類白細胞抗原和巨噬細胞呈負相關(guān)（圖2I）。

基于CRGs的聚類分析

基于CRGs表達差異臭胜，作者采用consensus clustering方法來研究CCMs中銅死亡的模式莫其，最終確定了兩個不同的聚類（Cluster 1與Cluster 2癞尚；圖3A-F）。Cluster 1與Cluster 2之間有281個基因上調(diào)榜配，266個基因下調(diào)（圖3G）否纬。GO富集分析表明，這些DEGs主要富集在免疫調(diào)節(jié)蛋褥、血管發(fā)育和突觸相關(guān)的功能中（圖3H）。進一步分析這些聚類中的CRGs表達睛驳，發(fā)現(xiàn)有七個基因表現(xiàn)出差異表達（CDKN2A, FDX1, LIAS和LIPT1在Cluster 1中高表達烙心，而GLS, PDHA1和PDHB在Cluster 2中高表達）（圖3I）。由于既往文獻表明FDX1和LIAS在銅死亡誘導(dǎo)的細胞死亡中起正調(diào)控作用乏沸，而GLS起負調(diào)控作用淫茵，Cluster 1中的患者可能更容易經(jīng)歷銅死亡的正向促進，而Cluster 2中的患者可能獲得相反的調(diào)控效果蹬跃。最后匙瘪，作者進行了GSEA富集分析（圖3J, K）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性在Cluster 1的基因高表達組中顯著激活蝶缀，而腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合在Cluster 2的基因高表達組中激活（圖3J）丹喻。此外，抗壞血酸與醛糖酸代謝和細胞色素P450代謝主要富集在Cluster 1中翁都，而糖基磷脂酰肌醇合成和檸檬酸循環(huán)TCA循環(huán)富集在Cluster 2組中（圖3K）碍论。

不同亞型CCMs相關(guān)的關(guān)鍵基因識別

上文提及，作者在Cluster 1和Cluster 2之間柄慰、CCMs組與對照組之間篩選了DEGs鳍悠，在此基礎(chǔ)上，作者發(fā)現(xiàn)其中交集有273個DEGs（圖4A）并進行LASSO回歸和隨機森林分析坐搔。其中藏研，LASSO分析共識別出14個與CCMs相關(guān)的特征基因（圖4B和4C）。隨機森林則選出了10個特征基因（圖4D）概行。將者兩種算法的結(jié)果交集得到了三個重疊基因蠢挡，即PFDN4、CEMIP和BTBD10（圖4E）占锯，這些基因被作為后續(xù)研究的關(guān)鍵基因袒哥。比較兩個聚類發(fā)現(xiàn)，BTBD10和PFDN4在Cluster 1中高表達消略，而CEMIP在Cluster 2中高表達堡称。此外，所有三個基因在CCMs中顯著上調(diào)（圖4F和4G）艺演。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中却紧，作者還鑒定了與CCMs相關(guān)的致病基因桐臊，其中，BRAF晓殊、TNF断凶、SYNGAP1、DLL4和ARID1B在Cluster 1中高表達巫俺；PIK3R2认烁、NR2F2、TGFB1和ZIC1在Cluster 2中高表達（圖4H）介汹。進一步分析表明却嗡，三個關(guān)鍵基因的表達水平與多種疾病相關(guān)基因顯著相關(guān)，包括BTBD10與DLL4之間的正相關(guān)（r = 0.887, P<0.001）以及PFDN4與ENG之間的負相關(guān)（r = -0.725, P<0.001）（圖4I）嘹承。

CCMs亞型的免疫浸潤特征

既往文獻報道CCMs的免疫微環(huán)境主要由免疫細胞窗价、細胞外基質(zhì)、各種生長和炎癥因子以及獨特的理化特性組成叹卷。作者通過ssGSEA分析發(fā)現(xiàn)Cluster 1和Cluster 2之間在多種免疫細胞中存在顯著差異撼港，包括活化的樹突狀細胞、B細胞骤竹、檢查點帝牡、DCs、促炎細胞瘤载、巨噬細胞否灾、中性粒細胞、漿細胞樣樹突細胞鸣奔、T細胞共抑制墨技、輔助性T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞和II型干擾素反應(yīng)挎狸】弁簦總的來說，Cluster 2的免疫浸潤水平顯著高于Cluster 1（圖5A）锨匆。隨后作者采用CIBERSORT算法驗證ssGSEA的結(jié)果崭别，得到了相一致的結(jié)果（圖5B）：巨噬細胞，特別是M0和M2類型恐锣，占所有免疫細胞的顯著比例（圖5C）茅主。此外，作者還發(fā)現(xiàn)來自Cluster 1的關(guān)鍵基因BTBD10和PFDN4與大多數(shù)免疫細胞土榴，包括巨噬細胞和B細胞诀姚，呈顯著負相關(guān)（圖5D和5F）。相反玷禽，來自Cluster 2的關(guān)鍵基因CEMIP與大多數(shù)免疫細胞呈顯著正相關(guān)（圖5E）赫段。

關(guān)鍵基因的信號通路富集分析

既然三個關(guān)鍵基因（BTBD10呀打、CEMIP、PFDN4）如此重要糯笙，接下來作者便探討它們可能通過哪些分子機制影響CCMs的進展贬丛。GSVA結(jié)果顯示，BTBD10高表達時给涕，主要激活的信號通路包括mTORC1信號通路豺憔、脂肪酸代謝和PI3K-AKT-mTOR信號通路（圖6A）。CEMIP高表達時稠炬，主要富集在IL6/JAK/STAT3焕阿、血管生成、TNFA通過NFκB的信號傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)信號通路中（圖6B）首启。而PFDN4高表達則顯著富集在膽汁酸代謝、KRAS信號和脂肪酸代謝通路中（圖6C）撤摸。此外毅桃，GSEA分析結(jié)果表明，BTBD10在化學(xué)趨化因子准夷、NOD樣受體和Toll樣受體信號通路中富集（圖6D）钥飞；CEMIP在cAMP信號通路、谷氨酸能突觸和逆行內(nèi)源性大麻素信號通路中富集（圖6E）衫嵌；PFDN4則富集在鈣信號通路读宙、cAMP信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中（圖6F）。

關(guān)鍵基因在人類內(nèi)皮細胞（ECs）中的驗證

為了驗證CCMs中關(guān)鍵基因的表達和功能楔绞，作者在人類CCMs的數(shù)據(jù)集GSE233210進行驗證（圖7A）结闸。在CCMs_ECs和對照正常ECs的比較中，共識別到149個上調(diào)的DEGs和9726個下調(diào)的DEGs（圖7B）酒朵。上調(diào)的DEGs主要富集在與免疫調(diào)節(jié)和血管發(fā)育相關(guān)的通路中（圖7C）桦锄，這與之前的分析結(jié)果一致（圖2C）。在CRGs的表達方面蔫耽，CDKN2A结耀、FDX1、LIAS匙铡、BTBD10图甜、PFDN4和CEMIP在CCMs_ECs組中上調(diào)，而GLS鳖眼、MTF1和PDHB在對照_ECs組中上調(diào)（圖7D-E）黑毅。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，BTBD10和PFDN4在與CRGs的關(guān)系分析中表現(xiàn)出一致性具帮，顯著正相關(guān)于FDX1博肋、LIAS和DLAT低斋，而顯著負相關(guān)于GLS和PDHA1（圖7F）。CEMIP與FDX1匪凡、LIAS和DLAT顯著負相關(guān)膊畴，而與GLS和PDHA1顯著正相關(guān)（圖7F）。免疫浸潤分析結(jié)果顯示病游，CCMs_ECs組的免疫細胞浸潤高于對照組（圖7G）唇跨，這與之前的CCMs總體樣本分析結(jié)果一致。關(guān)鍵基因與免疫細胞的相關(guān)性分析表明衬衬，BTBD10和PFDN4與大多數(shù)免疫細胞呈負相關(guān)买猖，而CEMIP與免疫細胞呈正相關(guān)（圖7H-J）。

在本醫(yī)院中心隊列中驗證關(guān)鍵基因

為了進一步確認這些關(guān)鍵基因在CCMs中的表達滋尉，作者對自己醫(yī)院中心的隊列中CCMs樣本進行了免疫熒光共定位和蛋白表達水平評估玉控。BTBD10、CEMIP和PFDN4在CCMs組織中與VE-cadherin（ECs的標志性蛋白）共定位（圖8A）狮惜。而CCMs組中的BTBD10高诺、CEMIP和PFDN4水平顯著高于對照組，表明這些關(guān)鍵基因在CCMs組織中功能性表達（圖8B-E）碾篡。

單細胞水平驗證關(guān)鍵基因

作者分析了來自scRNA-seq數(shù)據(jù)集（GSE155788）的4個樣本（2個正常樣本虱而，2個CCMs樣本）。共獲得14623個正常組織細胞和15978個CCMs組織細胞开泽。細胞被分類為五種主要類型牡拇，包括紅細胞、巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞（MΦ/MG）穆律、膠質(zhì)細胞惠呼、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞（圖9A）。其中众旗，內(nèi)皮細胞可被細分為七個亞群罢杉，包括動脈、動脈毛細血管贡歧、靜脈毛細血管滩租、靜脈毛細血管（Mki67+）、靜脈利朵、尖端細胞和尖端細胞（Mki67+）（圖9B-C）律想。共表達分析中，Btbd10和Pfdn4在CCMs的多個內(nèi)皮細胞中共表達绍弟，特別是在Cluster 1中（圖9C）技即。與對照組相比，Btbd10和Pfdn4在CCMs的尖端細胞（Mki67+）中高度表達（圖9D）樟遣。隨后進行的相關(guān)性分析結(jié)果表明Btbd10在多個細胞亞群中與多個CRGs顯著相關(guān)而叼，特別是在尖端細胞（Mki67+）中與Fdx1身笤、Mtf1和Gls呈正相關(guān)。因此葵陵，Btbd10在內(nèi)皮細胞中的作用成為后續(xù)探索的重點液荸。

Btbd10調(diào)節(jié)CCMs的潛在銅死亡機制

作者通過細胞通訊分析發(fā)現(xiàn)，對照組與CCMs樣本之間的細胞間相互作用存在顯著差異脱篙，特別是MΦ/MG與大多數(shù)其他細胞之間的相互作用強度顯著增強（圖10A）娇钱。作者將MΦ/MG分為M1和M2兩個亞群，探討它們在CCMs樣本中高表達關(guān)鍵基因的內(nèi)皮細胞之間相互作用（圖10B）绊困。結(jié)果顯示文搂，M2 MΦ/MG與Btbd10+內(nèi)皮細胞和Pfdn4+內(nèi)皮細胞之間的相互作用強度高于其他細胞，表明這兩個內(nèi)皮細胞亞群在與M2 MΦ/MG的相互作用中可能起主要功能作用秤朗。然而煤蹭，Cemip+內(nèi)皮細胞與M2 MΦ/MG之間的相互作用較弱，表明Cemip+內(nèi)皮細胞與M2 MΦ/MG之間的相互作用可能不是主要功能相互作用（圖10B）取视。進一步深入分析了發(fā)現(xiàn)高表達關(guān)鍵基因的內(nèi)皮細胞與MΦ/MG之間主要通過Ptn-Ncl和Fn1-(Itga4+Itgb1) 配體通路進行通信（圖10C）疯兼。在M2 MΦ/MG與Btbd10+內(nèi)皮細胞之間的主要通信通路是通過Ptn-Ncl通路， Btbd10+內(nèi)皮細胞與M2 MΦ/MG之間的通信主要通過Fn1-(Itga4+Itgb1)通路（圖10D）贫途。

Btbd10與銅死亡的關(guān)鍵基因Fdx1在CCMs樣本的尖端細胞（Mki67+）中顯著正相關(guān)，而在對照組中無顯著相關(guān)性（圖11A）待侵。進一步的共定位結(jié)果也提示Btbd10和Fdx1在尖端細胞（Mki67+）中的共表達（圖11B）丢早。這些結(jié)果表明Btbd10與CCMs細胞水平的銅死亡存在重要關(guān)聯(lián)。因此秧倾，作者進一步細化出CCMs樣本中的尖端細胞（Mki67+）怨酝，并通過細胞通訊分析了它們與其他細胞群的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)那先，尖端細胞（Mki67+）與MΦ/MG农猬，特別是M2 MΦ/MG之間的相互作用強度顯著（圖11C）。同時售淡，與低表達Btbd10的尖端細胞（Mki67+）相比斤葱，高表達Btbd10的尖端細胞（Mki67+）與M2 MΦ/MG之間的相互作用強度顯著增加（圖11D）。最后揖闸，作者分析了高表達和低表達Btbd10的尖端細胞（Mki67+）與M2 MΦ/MG之間的配體-受體通路揍堕，發(fā)現(xiàn)它們主要通過Esam-Esam、Col4a1-(Itga1+Itgb1)和Ptn-Ncl配體通路進行相互作用（圖11E）汤纸。其中衩茸，M2 MΦ/MG與高表達Btbd10的尖端細胞（Mki67+）之間的主要相互作用通路是通過Esam-Esam配體通路，而M2 MΦ/MG與低表達Btbd10的尖端細胞（Mki67+）之間的主要相互作用通路是通過Col4a1-(Itga1+Itgb1)和Ptn-Ncl（圖11F）贮泞。這些發(fā)現(xiàn)表明M2 MΦ/MG可能通過上述配體-受體通路與尖端細胞（Mki67+）相互作用楞慈，并驅(qū)動尖端細胞（Mki67+）中的銅死亡過程幔烛，其中Btbd10可能在促進銅死亡中發(fā)揮作用。

研究總結(jié)：

這篇研究發(fā)現(xiàn)CCMs中存在兩種不同的亞型囊蓝，其CCMs亞型的DEGs表達和免疫浸潤情況不同饿悬。確定并驗證了三個關(guān)鍵CRGs基因（BTBD10, PFDN4, CEMIP），這些基因可能與CCMs的病理進展密切相關(guān)慎颗，并在CCMs的內(nèi)皮細胞中顯著上調(diào)乡恕。此外，單細胞RNA測序分析揭示了這些關(guān)鍵基因的細胞共表達模式俯萎，特別是BTBD10和PFDN4在內(nèi)皮細胞中的高表達傲宜，以及BTBD10與關(guān)鍵銅死亡基因FDX1在Mki67+尖端細胞中的共定位。這些發(fā)現(xiàn)表明銅死亡在CCMs血管生成中的重要作用夫啊，并提示了這些基因與免疫細胞之間的相互作用在CCMs發(fā)病機制中的潛在角色函卒。