影響因子:11
研究概述:腦海綿狀血管畸形(CCMs)是一種常見的神經(jīng)血管畸形棘捣,可以以散發(fā)或家族形式出現(xiàn)在年輕成年人中。這些畸形的特點是靜脈毛細血管床的血管異常擴張,沒有間隔的腦實質(zhì)乍恐。這種畸形的血流速度慢评疗,容易形成血栓∫鹆遥患者終生面臨中風(fēng)百匆、癲癇和局灶性神經(jīng)功能缺損的風(fēng)險,目前尚無有效的藥物治療呜投。到目前為止加匈,盡管發(fā)現(xiàn)了與血管生成、血管生成和血管重塑相關(guān)的基因和遺傳風(fēng)險因素仑荐,但CCMs的精確發(fā)病機制尚不清楚雕拼,治療方法也未確定。銅死亡(cuproptosis)是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡形式粘招,與線粒體代謝有關(guān)啥寇,顯著不同于已知的細胞死亡形式如凋亡、鐵死亡和壞死洒扎。研究表明辑甜,銅死亡依賴于線粒體呼吸,由細胞內(nèi)銅的缺乏或過量引發(fā)袍冷。細胞內(nèi)銅過量可轉(zhuǎn)運至線粒體磷醋,與三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))中的脂肪酰化成分直接結(jié)合胡诗,導(dǎo)致蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激并最終導(dǎo)致細胞死亡邓线。基于全基因組CRISPR-Cas9篩選乃戈,已鑒定出多種與銅死亡相關(guān)的基因(CRGs)褂痰。本研究旨在通過綜合方法探討銅死亡在CCMs進展中的潛在作用,分析不同CCMs亞型中CRGs的貢獻症虑,篩選與銅死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因缩歪,并在外部數(shù)據(jù)集和本研究中的CCM樣本中驗證這些基因。此外谍憔,研究還探討了這些關(guān)鍵基因與CCMs免疫微環(huán)境之間的相互作用匪蝙,提供了免疫調(diào)節(jié)在疾病進程中的新見解。這些結(jié)果可能為了解CCMs發(fā)展的多樣性和復(fù)雜機制提供寶貴的見解习贫,并為潛在的治療策略鋪平道路逛球。具體流程如下:
本文生信部分本質(zhì)上是通過分型進行分組,對比不同組的各種差異苫昌,然后進行評分颤绕,比較分數(shù)與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系。
研究結(jié)果:
CCMs和對照組中的銅死亡相關(guān)的基因CRGs表達
作者分析了從21名患者獲得的兩個GEO表達譜數(shù)據(jù),其中對照組6名奥务,CCMs組15名(圖2A)物独。作者發(fā)現(xiàn)CCMs組和對照組之間共有2963個差異表達基因(DEGs),其中1169個基因在CCMs中上調(diào)氯葬,1794個基因下調(diào)(圖2B)挡篓。隨后進行的GO富集分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)的基因主要富集在與免疫和血管生成相關(guān)的通路中(圖2C)帚称。為了進一步研究CRGs在CCMs中的表達模式官研,作者探究了銅死亡基因在其中扮演的作用。研究結(jié)果表明闯睹,四個銅死亡基因(CDKN2A, GLS, PDHA1, 和 PDHB)在對照組和CCMs組之間存在顯著表達差異(圖2D-F)戏羽。其中,CDKN2A在CCMs中高表達瞻坝,而GLS, PDHA1, 和 PDHB在對照組中高表達蛛壳。此外, CRGs的相關(guān)性分析結(jié)果顯示所刀,F(xiàn)DX1與CDKN2A和DLD呈正相關(guān)衙荐,而GLS與CDKN2A和FDX1呈負相關(guān)(圖2G)。隨后作者采用CIBERSORT算法評估了樣本的免疫浸潤情況浮创。分析結(jié)果表明忧吟,與對照組相比,CCMs中存在顯著的免疫細胞浸潤斩披,包括巨噬細胞溜族、樹突狀細胞、B細胞和T細胞(圖2H)垦沉。進一步分析CRGs與免疫細胞的關(guān)系顯示煌抒,大多數(shù)CRGs與趨化因子受體、T細胞厕倍、抗原提呈細胞寡壮、樹突狀細胞和濾泡輔助性T細胞呈正相關(guān),而與APC共抑制讹弯、旁炎癥况既、調(diào)節(jié)性T細胞、I型干擾素反應(yīng)组民、腫瘤浸潤淋巴細胞棒仍、人類白細胞抗原和巨噬細胞呈負相關(guān)(圖2I)。
基于CRGs的聚類分析
基于CRGs表達差異臭胜,作者采用consensus clustering方法來研究CCMs中銅死亡的模式莫其,最終確定了兩個不同的聚類(Cluster 1與Cluster 2癞尚;圖3A-F)。Cluster 1與Cluster 2之間有281個基因上調(diào)榜配,266個基因下調(diào)(圖3G)否纬。GO富集分析表明,這些DEGs主要富集在免疫調(diào)節(jié)蛋褥、血管發(fā)育和突觸相關(guān)的功能中(圖3H)。進一步分析這些聚類中的CRGs表達睛驳,發(fā)現(xiàn)有七個基因表現(xiàn)出差異表達(CDKN2A, FDX1, LIAS和LIPT1在Cluster 1中高表達烙心,而GLS, PDHA1和PDHB在Cluster 2中高表達)(圖3I)。由于既往文獻表明FDX1和LIAS在銅死亡誘導(dǎo)的細胞死亡中起正調(diào)控作用乏沸,而GLS起負調(diào)控作用淫茵,Cluster 1中的患者可能更容易經(jīng)歷銅死亡的正向促進,而Cluster 2中的患者可能獲得相反的調(diào)控效果蹬跃。最后匙瘪,作者進行了GSEA富集分析(圖3J, K)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性在Cluster 1的基因高表達組中顯著激活蝶缀,而腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合在Cluster 2的基因高表達組中激活(圖3J)丹喻。此外,抗壞血酸與醛糖酸代謝和細胞色素P450代謝主要富集在Cluster 1中翁都,而糖基磷脂酰肌醇合成和檸檬酸循環(huán)TCA循環(huán)富集在Cluster 2組中(圖3K)碍论。
不同亞型CCMs相關(guān)的關(guān)鍵基因識別
上文提及,作者在Cluster 1和Cluster 2之間柄慰、CCMs組與對照組之間篩選了DEGs鳍悠,在此基礎(chǔ)上,作者發(fā)現(xiàn)其中交集有273個DEGs(圖4A)并進行LASSO回歸和隨機森林分析坐搔。其中藏研,LASSO分析共識別出14個與CCMs相關(guān)的特征基因(圖4B和4C)。隨機森林則選出了10個特征基因(圖4D)概行。將者兩種算法的結(jié)果交集得到了三個重疊基因蠢挡,即PFDN4、CEMIP和BTBD10(圖4E)占锯,這些基因被作為后續(xù)研究的關(guān)鍵基因袒哥。比較兩個聚類發(fā)現(xiàn),BTBD10和PFDN4在Cluster 1中高表達消略,而CEMIP在Cluster 2中高表達堡称。此外,所有三個基因在CCMs中顯著上調(diào)(圖4F和4G)艺演。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中却紧,作者還鑒定了與CCMs相關(guān)的致病基因桐臊,其中,BRAF晓殊、TNF断凶、SYNGAP1、DLL4和ARID1B在Cluster 1中高表達巫俺;PIK3R2认烁、NR2F2、TGFB1和ZIC1在Cluster 2中高表達(圖4H)介汹。進一步分析表明却嗡,三個關(guān)鍵基因的表達水平與多種疾病相關(guān)基因顯著相關(guān),包括BTBD10與DLL4之間的正相關(guān)(r = 0.887, P<0.001)以及PFDN4與ENG之間的負相關(guān)(r = -0.725, P<0.001)(圖4I)嘹承。
CCMs亞型的免疫浸潤特征
既往文獻報道CCMs的免疫微環(huán)境主要由免疫細胞窗价、細胞外基質(zhì)、各種生長和炎癥因子以及獨特的理化特性組成叹卷。作者通過ssGSEA分析發(fā)現(xiàn)Cluster 1和Cluster 2之間在多種免疫細胞中存在顯著差異撼港,包括活化的樹突狀細胞、B細胞骤竹、檢查點帝牡、DCs、促炎細胞瘤载、巨噬細胞否灾、中性粒細胞、漿細胞樣樹突細胞鸣奔、T細胞共抑制墨技、輔助性T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞和II型干擾素反應(yīng)挎狸】弁簦總的來說,Cluster 2的免疫浸潤水平顯著高于Cluster 1(圖5A)锨匆。隨后作者采用CIBERSORT算法驗證ssGSEA的結(jié)果崭别,得到了相一致的結(jié)果(圖5B):巨噬細胞,特別是M0和M2類型恐锣,占所有免疫細胞的顯著比例(圖5C)茅主。此外,作者還發(fā)現(xiàn)來自Cluster 1的關(guān)鍵基因BTBD10和PFDN4與大多數(shù)免疫細胞土榴,包括巨噬細胞和B細胞诀姚,呈顯著負相關(guān)(圖5D和5F)。相反玷禽,來自Cluster 2的關(guān)鍵基因CEMIP與大多數(shù)免疫細胞呈顯著正相關(guān)(圖5E)赫段。
關(guān)鍵基因的信號通路富集分析
既然三個關(guān)鍵基因(BTBD10呀打、CEMIP、PFDN4)如此重要糯笙,接下來作者便探討它們可能通過哪些分子機制影響CCMs的進展贬丛。GSVA結(jié)果顯示,BTBD10高表達時给涕,主要激活的信號通路包括mTORC1信號通路豺憔、脂肪酸代謝和PI3K-AKT-mTOR信號通路(圖6A)。CEMIP高表達時稠炬,主要富集在IL6/JAK/STAT3焕阿、血管生成、TNFA通過NFκB的信號傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)信號通路中(圖6B)首启。而PFDN4高表達則顯著富集在膽汁酸代謝、KRAS信號和脂肪酸代謝通路中(圖6C)撤摸。此外毅桃,GSEA分析結(jié)果表明,BTBD10在化學(xué)趨化因子准夷、NOD樣受體和Toll樣受體信號通路中富集(圖6D)钥飞;CEMIP在cAMP信號通路、谷氨酸能突觸和逆行內(nèi)源性大麻素信號通路中富集(圖6E)衫嵌;PFDN4則富集在鈣信號通路读宙、cAMP信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中(圖6F)。
關(guān)鍵基因在人類內(nèi)皮細胞(ECs)中的驗證
為了驗證CCMs中關(guān)鍵基因的表達和功能楔绞,作者在人類CCMs的數(shù)據(jù)集GSE233210進行驗證(圖7A)结闸。在CCMs_ECs和對照正常ECs的比較中,共識別到149個上調(diào)的DEGs和9726個下調(diào)的DEGs(圖7B)酒朵。上調(diào)的DEGs主要富集在與免疫調(diào)節(jié)和血管發(fā)育相關(guān)的通路中(圖7C)桦锄,這與之前的分析結(jié)果一致(圖2C)。在CRGs的表達方面蔫耽,CDKN2A结耀、FDX1、LIAS匙铡、BTBD10图甜、PFDN4和CEMIP在CCMs_ECs組中上調(diào),而GLS鳖眼、MTF1和PDHB在對照_ECs組中上調(diào)(圖7D-E)黑毅。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,BTBD10和PFDN4在與CRGs的關(guān)系分析中表現(xiàn)出一致性具帮,顯著正相關(guān)于FDX1博肋、LIAS和DLAT低斋,而顯著負相關(guān)于GLS和PDHA1(圖7F)。CEMIP與FDX1匪凡、LIAS和DLAT顯著負相關(guān)膊畴,而與GLS和PDHA1顯著正相關(guān)(圖7F)。免疫浸潤分析結(jié)果顯示病游,CCMs_ECs組的免疫細胞浸潤高于對照組(圖7G)唇跨,這與之前的CCMs總體樣本分析結(jié)果一致。關(guān)鍵基因與免疫細胞的相關(guān)性分析表明衬衬,BTBD10和PFDN4與大多數(shù)免疫細胞呈負相關(guān)买猖,而CEMIP與免疫細胞呈正相關(guān)(圖7H-J)。
在本醫(yī)院中心隊列中驗證關(guān)鍵基因
為了進一步確認這些關(guān)鍵基因在CCMs中的表達滋尉,作者對自己醫(yī)院中心的隊列中CCMs樣本進行了免疫熒光共定位和蛋白表達水平評估玉控。BTBD10、CEMIP和PFDN4在CCMs組織中與VE-cadherin(ECs的標志性蛋白)共定位(圖8A)狮惜。而CCMs組中的BTBD10高诺、CEMIP和PFDN4水平顯著高于對照組,表明這些關(guān)鍵基因在CCMs組織中功能性表達(圖8B-E)碾篡。
單細胞水平驗證關(guān)鍵基因
作者分析了來自scRNA-seq數(shù)據(jù)集(GSE155788)的4個樣本(2個正常樣本虱而,2個CCMs樣本)。共獲得14623個正常組織細胞和15978個CCMs組織細胞开泽。細胞被分類為五種主要類型牡拇,包括紅細胞、巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞(MΦ/MG)穆律、膠質(zhì)細胞惠呼、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞(圖9A)。其中众旗,內(nèi)皮細胞可被細分為七個亞群罢杉,包括動脈、動脈毛細血管贡歧、靜脈毛細血管滩租、靜脈毛細血管(Mki67+)、靜脈利朵、尖端細胞和尖端細胞(Mki67+)(圖9B-C)律想。共表達分析中,Btbd10和Pfdn4在CCMs的多個內(nèi)皮細胞中共表達绍弟,特別是在Cluster 1中(圖9C)技即。與對照組相比,Btbd10和Pfdn4在CCMs的尖端細胞(Mki67+)中高度表達(圖9D)樟遣。隨后進行的相關(guān)性分析結(jié)果表明Btbd10在多個細胞亞群中與多個CRGs顯著相關(guān)而叼,特別是在尖端細胞(Mki67+)中與Fdx1身笤、Mtf1和Gls呈正相關(guān)。因此葵陵,Btbd10在內(nèi)皮細胞中的作用成為后續(xù)探索的重點液荸。
Btbd10調(diào)節(jié)CCMs的潛在銅死亡機制
作者通過細胞通訊分析發(fā)現(xiàn),對照組與CCMs樣本之間的細胞間相互作用存在顯著差異脱篙,特別是MΦ/MG與大多數(shù)其他細胞之間的相互作用強度顯著增強(圖10A)娇钱。作者將MΦ/MG分為M1和M2兩個亞群,探討它們在CCMs樣本中高表達關(guān)鍵基因的內(nèi)皮細胞之間相互作用(圖10B)绊困。結(jié)果顯示文搂,M2 MΦ/MG與Btbd10+內(nèi)皮細胞和Pfdn4+內(nèi)皮細胞之間的相互作用強度高于其他細胞,表明這兩個內(nèi)皮細胞亞群在與M2 MΦ/MG的相互作用中可能起主要功能作用秤朗。然而煤蹭,Cemip+內(nèi)皮細胞與M2 MΦ/MG之間的相互作用較弱,表明Cemip+內(nèi)皮細胞與M2 MΦ/MG之間的相互作用可能不是主要功能相互作用(圖10B)取视。進一步深入分析了發(fā)現(xiàn)高表達關(guān)鍵基因的內(nèi)皮細胞與MΦ/MG之間主要通過Ptn-Ncl和Fn1-(Itga4+Itgb1) 配體通路進行通信(圖10C)疯兼。在M2 MΦ/MG與Btbd10+內(nèi)皮細胞之間的主要通信通路是通過Ptn-Ncl通路, Btbd10+內(nèi)皮細胞與M2 MΦ/MG之間的通信主要通過Fn1-(Itga4+Itgb1)通路(圖10D)贫途。
Btbd10與銅死亡的關(guān)鍵基因Fdx1在CCMs樣本的尖端細胞(Mki67+)中顯著正相關(guān),而在對照組中無顯著相關(guān)性(圖11A)待侵。進一步的共定位結(jié)果也提示Btbd10和Fdx1在尖端細胞(Mki67+)中的共表達(圖11B)丢早。這些結(jié)果表明Btbd10與CCMs細胞水平的銅死亡存在重要關(guān)聯(lián)。因此秧倾,作者進一步細化出CCMs樣本中的尖端細胞(Mki67+)怨酝,并通過細胞通訊分析了它們與其他細胞群的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)那先,尖端細胞(Mki67+)與MΦ/MG农猬,特別是M2 MΦ/MG之間的相互作用強度顯著(圖11C)。同時售淡,與低表達Btbd10的尖端細胞(Mki67+)相比斤葱,高表達Btbd10的尖端細胞(Mki67+)與M2 MΦ/MG之間的相互作用強度顯著增加(圖11D)。最后揖闸,作者分析了高表達和低表達Btbd10的尖端細胞(Mki67+)與M2 MΦ/MG之間的配體-受體通路揍堕,發(fā)現(xiàn)它們主要通過Esam-Esam、Col4a1-(Itga1+Itgb1)和Ptn-Ncl配體通路進行相互作用(圖11E)汤纸。其中衩茸,M2 MΦ/MG與高表達Btbd10的尖端細胞(Mki67+)之間的主要相互作用通路是通過Esam-Esam配體通路,而M2 MΦ/MG與低表達Btbd10的尖端細胞(Mki67+)之間的主要相互作用通路是通過Col4a1-(Itga1+Itgb1)和Ptn-Ncl(圖11F)贮泞。這些發(fā)現(xiàn)表明M2 MΦ/MG可能通過上述配體-受體通路與尖端細胞(Mki67+)相互作用楞慈,并驅(qū)動尖端細胞(Mki67+)中的銅死亡過程幔烛,其中Btbd10可能在促進銅死亡中發(fā)揮作用。
研究總結(jié):
這篇研究發(fā)現(xiàn)CCMs中存在兩種不同的亞型囊蓝,其CCMs亞型的DEGs表達和免疫浸潤情況不同饿悬。確定并驗證了三個關(guān)鍵CRGs基因(BTBD10, PFDN4, CEMIP),這些基因可能與CCMs的病理進展密切相關(guān)慎颗,并在CCMs的內(nèi)皮細胞中顯著上調(diào)乡恕。此外,單細胞RNA測序分析揭示了這些關(guān)鍵基因的細胞共表達模式俯萎,特別是BTBD10和PFDN4在內(nèi)皮細胞中的高表達傲宜,以及BTBD10與關(guān)鍵銅死亡基因FDX1在Mki67+尖端細胞中的共定位。這些發(fā)現(xiàn)表明銅死亡在CCMs血管生成中的重要作用夫啊,并提示了這些基因與免疫細胞之間的相互作用在CCMs發(fā)病機制中的潛在角色函卒。