這篇文章的目的是為了幫助理解Seurat在單細胞轉(zhuǎn)錄組分析中可以做哪些事，并且對整體的數(shù)據(jù)分析流程有一個整體的認識。并不包含代碼洪己。
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1.單細胞測序分析的整體流程是怎樣的

以10x genomics為例

10x genomics

單細胞轉(zhuǎn)錄組分析流程

單細胞轉(zhuǎn)錄組分析流程

barcodes.tsv.gz : 包含barcodes信息
features.tsv.gz : 包含的是基因的信息
matrix.mtx.gz : 對于每一個barcodes而言务冕，對每一個細胞表達的信息
但是Cell Ranger的質(zhì)控并不嚴格，所以仍需要一步數(shù)據(jù)質(zhì)控鉴未，去過濾低質(zhì)量細胞和低豐度基因。

2.Seurat能做什么

首先鸠姨，在這個流程圖中Seurat能進行分析的部分有“數(shù)據(jù)質(zhì)控→基因表達標準化→降維聚類→marker基因鑒定/細胞類型鑒定/細胞亞群分析”
（擬時序分析需要用到另一個R包铜秆，Monocle）

其次，Seurat自帶繪圖函數(shù)Dimplot讶迁，可以對結(jié)果進行可視化连茧。如果對Dimplot的效果不滿意，也可以將降維信息提取出來之后使用ggplot2作圖巍糯，這里有一個使用示例 利用 ggplot2 繪制 Seurat 對象中的 tSNE 或 UMAP 圖

3.Seurat之數(shù)據(jù)質(zhì)控

需要數(shù)據(jù)質(zhì)控的原因：在10x捕獲細胞的原理中啸驯，理論上一個油包水微滴中只有一個細胞，但在實際測序中祟峦，一個微滴中可能沒有細胞罚斗，也可能有2個甚至多個細胞。這就導(dǎo)致了某些微滴中測序基本為空宅楞，或者基因檢測數(shù)量非常高针姿，因此需要通過數(shù)據(jù)質(zhì)控將這部分異常的數(shù)據(jù)過濾掉。

另外還有一種情況厌衙，對于凋亡狀態(tài)細胞或受到損傷的細胞而言距淫，其細胞內(nèi)的線粒體基因比例會非常高，所以對于線粒體基因比例非常高的細胞也是低質(zhì)量的細胞婶希，對于這部分細胞也是要過濾掉的榕暇。

一般過濾標準：

每個細胞的基因數(shù)限制一般選用200個基因為下限值；2000-2500個基因為上限值喻杈；
線粒體基因的比例則可根據(jù)具體數(shù)據(jù)彤枢，看線粒體基因比例主要集中的范圍而定，越低越好筒饰，如5%缴啡。

4.Seurat之降維聚類分析

線性降維：PCA
非線性降維：tSNE、UMAP

PCA側(cè)重于從大量基因表達信息提取出對整個基因表達量影響最大的效應(yīng)（即主成分）龄砰，所以PCA分析就是將數(shù)據(jù)中大量基因表達信息濃縮到少數(shù)幾個代表樣本中主要效應(yīng)的變量中盟猖，側(cè)重于抓取數(shù)據(jù)中隱藏的主要效應(yīng)讨衣，從而在這個主要效應(yīng)的維度中去直觀的展現(xiàn)出樣本之間的差異（距離越遠换棚，差異越大）式镐。更適合于常規(guī)轉(zhuǎn)錄組中，展示樣本之間的表達情況固蚤。

而對于單細胞測序分析娘汞，目的是區(qū)分出不同細胞亞群，而能夠區(qū)分細胞亞群的效應(yīng)往往不是大量基因的差異夕玩，而是一些微小效應(yīng)你弦，也就是少量的標記基因的差異，這時PCA就不再適用燎孟，而tSNE則是將原本在原始數(shù)據(jù)集中比較相似的細胞禽作，在降維之后的數(shù)據(jù)集中仍能保持相似性，并且能夠聚集在一起揩页。

PCA是想辦法把不相似的數(shù)據(jù)區(qū)分開旷偿，在二維坐標圖上展示的時候，不相似的點之間間隔比較遠爆侣；
tSNE則是除了把不相似的點盡量分開的同時萍程，盡量讓相似性質(zhì)的點距離近一些。

PCA（左）和tSNE（右）

單細胞測序數(shù)據(jù)一般處理流程：

先使用線性降維做一個預(yù)處理兔仰，然后再進行非線性聚類分析茫负。

5.Seurat之Marker基因鑒定

Marker基因的篩選標準：該基因在指定細胞群的絕大多數(shù)細胞中有較高的表達，而在其余細胞類群中只有少部分表達乎赴，且該基因在此細胞群相對于其他細胞群中顯著上調(diào)表達忍法。

Seurat可以進行兩個細胞群或者多個細胞群之間的差異基因的分析。

6.Seurat之細胞類型鑒定

鑒定出每一個細胞群的marker基因之后榕吼，就可以選定每個細胞群的代表性marker基因來繪制熱圖缔赠。

heatmap

這里左側(cè)的基因就是選定的marker基因，最上方的彩條代表著細胞的分群友题，
熱圖的主體部分是每一個細胞表達對應(yīng)的marker基因的表達量嗤堰。
通過熱圖可以直觀展示和判定每個分群的細胞類型。

在判定了每個分群對應(yīng)的細胞類型之后度宦，可以把細胞類型的信息加入到tSNE圖中的展示中踢匣。

細胞類型的展示

7.Seurat之某個基因的表達的展示

A.featureplot圖

CD79A的表達情況在tSNE圖中的映射

B.小提琴圖

在不同的細胞群中CD79A的表達

C.山脈圖

在不同類群的細胞中CCL5的表達水平