文獻(xiàn)：導(dǎo)致 COVID-19 的 SARS-CoV-2 sarbecovirus 譜系的進(jìn)化起源
發(fā)表時(shí)間：2020年7月
文章整體思路
1、無(wú)斷點(diǎn)基因組區(qū)域的重組分析與鑒定
文章嘗試解釋人類冠狀病毒 SARS-CoV-2的進(jìn)化譜系欠痴，即嘗試解釋宿主物種的作用酝掩、重組的作用，進(jìn)化中與其他動(dòng)物病毒分化的時(shí)間觉既。用3SEQ方法對(duì)包含SARS-CoV和SARS-CoV-2的sarbecoviruses亞屬的68個(gè)病毒進(jìn)行斷點(diǎn)的分布和序列的推測(cè)研究贴唇，表明病毒經(jīng)歷了頻繁的重組遂鹊。頻繁的重組使推測(cè)病毒的進(jìn)化譜系十分具有挑戰(zhàn)性丽柿，于是恢准，研究者結(jié)合 3SEQ 推斷的斷點(diǎn)、GARD 推斷的斷點(diǎn)和 PI 信號(hào)這三種方法甫题，去除基因組重組區(qū)域馁筐，推測(cè) SARS-CoV-2的進(jìn)化譜系募强。結(jié)果表明荆陆， SARS-CoV-2 和 RaTG13 具有單一祖先譜系。來(lái)自浙江省的另外兩種蝙蝠病毒（CoVZXC21 和 CoVZC45）屬于該譜系秦躯，是 2005 年至 2007 年間采樣的 RaTG13/SARS-CoV-2 譜系和香港蝙蝠病毒進(jìn)化枝的重組體炎码。
a. 由 3SEQ 方法推斷的斷點(diǎn)盟迟，由68個(gè)病毒序列中支持該位置為斷點(diǎn)的百分比表示。如果序列是相同重組事件的后代辅肾，則斷點(diǎn)可以在序列之間共享队萤。粉紅色轮锥、綠色和橙色條顯示無(wú)斷點(diǎn)區(qū)域 (BFR) 矫钓，區(qū)域 A（nt 13,291–19,628）顯示兩個(gè)剪切后的片段，產(chǎn)生區(qū)域 A'（nt 13,291–14,932舍杜、15,405–17,162新娜、18,009–19,628）。區(qū)域 B 和 C 分別跨越 nt 3,625–9,150 和 9,261–11,795既绩。連接區(qū)域 A'BC 是 NRR1概龄。開(kāi)放閱讀框以箭頭的形式標(biāo)注在斷點(diǎn)圖上方，可變環(huán)區(qū)域顯示在 S 蛋白中饲握。
b. SARS-CoV-2 與其他序列之間的相似性圖私杜，包括 RaTG13（黑色）蚕键、SARS-CoV（粉色）和兩個(gè)穿山甲序列（橙色）。陰影區(qū)域?qū)?yīng)于 S 蛋白衰粹。
c. 基于 2007 年在肯尼亞采樣的病毒（BtKy72锣光；外類群，圖像中未顯示）構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)铝耻。顯示了 sarbecovirus 比對(duì)的五個(gè) BFR誊爹。用于系統(tǒng)發(fā)育推斷的核苷酸位置是 147–695、962–1,686（第一棵樹(shù)）瓢捉、3,625–9,150（第二棵樹(shù)频丘，也是 BFR B）、9,261–11,795（第三棵樹(shù)泡态，也是 BFR C）搂漠、12,443–19,638（第四棵樹(shù)）和23,631–24,633、24,795–25,847某弦、27,702–28,843 和 29,574–30,650（第五棵樹(shù)）状答。相關(guān)的 bootstrap 值顯示在分支上，灰色陰影區(qū)域顯示沿基因組表現(xiàn)出系統(tǒng)發(fā)育不一致的序列刀崖。
2惊科、S蛋白子區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系
由于 SARS-CoV-2的S 蛋白與過(guò)去的重組事件或可能的趨同進(jìn)化有關(guān)，研究者專門(mén)研究了 S 蛋白的幾個(gè)子區(qū)域——S1 的 N 端結(jié)構(gòu)域亮钦、S1 的 C 端結(jié)構(gòu)域馆截、可變C-末端結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)和S2。SARS-CoV-2 中的可變環(huán)區(qū)域顯示出與 2019 年穿山甲冠狀病毒序列的相似性蜂莉，高于與 RaTG13 蝙蝠病毒的相似性蜡娶。這讓研究者猜測(cè) SARS-CoV-2 是Pangolin Guangdong 2019 和 RaTG13 祖先的重組體，通過(guò)重組和強(qiáng)純化選擇出現(xiàn) SARS-CoV-2映穗。然而窖张，仔細(xì)觀察后發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的相對(duì)差異表明 SARS-CoV-2 不太可能從 Pangolin-2019 的祖先那里獲得可變環(huán)蚁滋，因?yàn)檫@兩個(gè)序列在整個(gè) S 蛋白（不包括 N 端結(jié)構(gòu)域）中大約有 10-15% 的差異宿接。RaTG13 在可變環(huán)區(qū)域中更加分散，因此可能是與未被采樣的蝙蝠中sarbecovirus的重組的產(chǎn)物辕录。這是值得注意的睦霎，因?yàn)榭勺儹h(huán)區(qū)域包含 RBD 中的六個(gè)關(guān)鍵接觸殘基，這些殘基使 SARS-CoV-2 具有 ACE2 結(jié)合特異性走诞。 這些殘基也在Pangolin Guangdong 2019序列中副女。對(duì)這些共享的 ACE2 特異性殘基的最簡(jiǎn)單的解釋是，它們存在于 SARS-CoV-2蚣旱、RaTG13 和Pangolin-2019 的共同祖先中碑幅，并通過(guò)導(dǎo)致 RaTG13 的譜系中的重組丟失戴陡。這為 SARS-CoV-2 譜系是蝙蝠直接或幾乎直接的人畜共患病跳躍的結(jié)果提供了令人信服的支持，因?yàn)殛P(guān)鍵的 ACE2 結(jié)合殘基存在于蝙蝠中傳播的病毒中沟涨。（也就是說(shuō)猜欺，ACE2 特異性殘基存在于SARS-CoV-2和RaTG13 的祖先中，并且在RaTG13 的譜系中丟失拷窜。盡管RaTG13與SARS-CoV-2基因組差異較大且不具有ACE2 特異性殘基等關(guān)鍵的基因开皿，很有可能在一些我們未檢測(cè)到的蝙蝠體內(nèi)，RaTG13與其祖先進(jìn)化出來(lái)的其他譜系的病毒發(fā)生重組篮昧，慢慢進(jìn)化出SARS-CoV-2這種人畜共患病病毒赋荆。）
如底部條形圖所示，除了 C 端域的 222-nt 可變環(huán)區(qū)域懊昨，SARS-CoV-2 和 RaTG13 是最密切相關(guān)的（它們最近的共同祖先節(jié)點(diǎn)用綠色圓圈表示）窄潭。在可變環(huán)區(qū)域，RaTG13 的TMRCA（time to most recent common ancestor) 與其他部分有很大差異酵颁，超出了 SARS-CoV-2 和Pangolin Guangdong 2019 祖先的差異嫉你，這表明 RaTG13 是從更分歧和未被發(fā)現(xiàn)的蝙蝠譜系中獲得的。SARS-CoV-2 和 RaTG13（底部）之間的遺傳距離表明躏惋，它們的關(guān)系在除可變環(huán)外的所有區(qū)域中都是一致的幽污。除 N 端結(jié)構(gòu)域外，SARS-CoV-2 與廣東穿山甲 2019 之間的遺傳距離在所有地區(qū)都是一致的簿姨，這意味著這兩個(gè)序列在該地區(qū)不太可能發(fā)生重組距误。 NTD，N-末端結(jié)構(gòu)域扁位；CTD准潭，C-末端結(jié)構(gòu)域。
3域仇、非重組區(qū)域的進(jìn)化
非重組基因組區(qū)域（NRR1 ）的系統(tǒng)發(fā)育描述了不同區(qū)域蝙蝠 sarbecovirus 種群的明顯程度的空間結(jié)構(gòu)的遺傳多樣性刑然。Kenya/Bulgaria作為外類群，下圖中包含人暇务、蝙蝠和穿山甲中采樣的病毒泼掠。雖然穿山甲可能是蝙蝠病毒進(jìn)入人類的中間宿主——它們會(huì)患上嚴(yán)重的呼吸道疾病并且通常通過(guò)販賣(mài)與人接觸——但沒(méi)有證據(jù)表明穿山甲感染是蝙蝠病毒進(jìn)入人類的必要條件。
去除區(qū)域內(nèi)的潛在重組信號(hào)般卑，區(qū)域 A 縮短為 A' (5,017 nt)武鲁。區(qū)域 B 長(zhǎng) 5,525 nt爽雄。不同顏色表示地圖中不同省份蝠检。兩棵樹(shù)中系統(tǒng)發(fā)育位置不一致的五個(gè)序列用虛線標(biāo)識(shí)。
4挚瘟、用 SARS-CoV-2 譜系 NRR 的推算TMRCA
運(yùn)用上述的三種方法得出的NRR： NRR1 叹谁、 NRR2 以及NRA3饲梭，來(lái)推斷時(shí)間尺度上的進(jìn)化歷史。研究者試圖通過(guò)分析先后采樣的幾種冠狀病毒（包括 HCoV-OC43焰檩、MERS-CoV 和 SARS-CoV 病毒基因組）來(lái)確定合適的先驗(yàn)率分布以校準(zhǔn)時(shí)間測(cè)量樹(shù)憔涉。使用貝葉斯方法，研究者估計(jì)了快速的進(jìn)化速率： SARS 病毒1年內(nèi)的替換速率為每個(gè)位點(diǎn) yr –1 0.00169 個(gè)替換, 95% 最高后驗(yàn)密度 (HPD) 區(qū)間 (0.00131,0.00205)析苫；MERS-CoV病毒4年內(nèi)替換速率0.00078（0.00063,0.00092）兜叨；HCoV-OC43 在近 50年中的替換速率（0.00024 (0.00019,0.00029) 。這些差異體現(xiàn)了進(jìn)化速率的時(shí)間依賴性衩侥，即速率估計(jì)會(huì)隨著測(cè)量的時(shí)間尺度而有很大差異国旷，這是病毒中經(jīng)常觀察到的現(xiàn)象。在相對(duì)短的時(shí)間尺度上茫死，這種差異可以主要通過(guò)改變選擇壓力跪但，具有輕度的有害變體被通過(guò)純化選擇在更長(zhǎng)的時(shí)間尺度更強(qiáng)烈地消除說(shuō)明。與此一致峦萎，我們估計(jì)在較長(zhǎng)的進(jìn)化時(shí)間尺度內(nèi)非同義替換率比值隨之降低：分別有 SARS-CoV屡久，1.41 (1.20,1.68)、0.35 (0.30,0.41) 和 0.133 (0.129,0.136)和 HCoV-OC43爱榔。鑒于這些時(shí)間依賴的進(jìn)化速率動(dòng)態(tài)被环，較慢的速率適用于校準(zhǔn) sarbecovirus 進(jìn)化歷史。
a – c蛤售，Root-to-tip (RtT) divergence在不同時(shí)間尺度上展開(kāi)的三種冠狀病毒進(jìn)化歷史（HCoV-OC43 ( n ?= 37; a ) MERS ( n ?= 35; b ) 和 SARS( n ?= 69; c ))。d妒潭，針對(duì)相同的三個(gè)數(shù)據(jù)集（用與各自 RtT 散點(diǎn)圖中的數(shù)據(jù)點(diǎn)相同的顏色表示）以及使用兩個(gè)不同先驗(yàn)的可比 NRA3 的采樣時(shí)間范圍繪制的平均進(jìn)化率估計(jì)貝葉斯推理（紅點(diǎn)）悴能。
5、系統(tǒng)發(fā)育分歧時(shí)間的推測(cè)
使用最保守的方法 (NRR1)雳灾，SARS-CoV-2 和 RaTG13 的分歧時(shí)間估計(jì)為 1969 年（95% HPD：1930-2000）漠酿，而 SARS-CoV 與其最密切相關(guān)的蝙蝠序列之間的分歧時(shí)間估計(jì)為 1962 年（95 % HPD：1932-1988）。使用 NRR2 和 NRA3 估計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體一致： SARS-CoV-2 的分歧時(shí)間分別為 1982 (1948-2009) 和 1948 (1879-1999)谎亩； SARS-CoV 與其已知的最接近的蝙蝠病毒的分歧時(shí)間分別是 1952 (1906-1989) 和 1970 年（1932-1996 年）炒嘲。
SARS-CoV 的分歧時(shí)間比先前估計(jì)的日期早，因?yàn)橄惹暗墓烙?jì)是使用人類和果子貍宿主（以及一些密切相關(guān)的蝙蝠基因組）的 SARS-CoV 基因組集合獲得的匈庭，這意味著進(jìn)化速率是主要受短期 SARS 爆發(fā)規(guī)模的影響夫凸，并且可能偏高。事實(shí)上阱持，這些研究報(bào)告的發(fā)病率與我們估計(jì)的短期 SARS 發(fā)病率一致夭拌。與 SARS-CoV-2/RaTG13 譜系最密切相關(guān)的穿山甲病毒的估計(jì)分歧時(shí)間從 1851 年（1730-1958 年）到 1877 年（1746-1986 年），表明這些穿山甲譜系是從蝙蝠病毒中獲得的這導(dǎo)致了 SARS-CoV-2。目前對(duì)穿山甲的采樣并未暗示它們是中間宿主鸽扁。
以 NRR1 推斷的時(shí)間校準(zhǔn)的最大進(jìn)化枝可信度系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)蒜绽。灰色對(duì)應(yīng)蝙蝠病毒桶现，綠色對(duì)應(yīng)穿山甲躲雅，藍(lán)色對(duì)應(yīng) SARS-CoV，紅色對(duì)應(yīng) SARS-CoV-2骡和。黑色內(nèi)部節(jié)點(diǎn)圓圈的大小與后節(jié)點(diǎn)支持成正比相赁。顯示所有內(nèi)部節(jié)點(diǎn)年齡的 95% 可信區(qū)間條。插圖代表基于 NRR1慰于、NRR2 和 NRA3 的發(fā)散時(shí)間估計(jì)噪生。箱線圖顯示了 SARS-CoV-2（紅色）和 2002-2003 年 SARS-CoV 病毒（藍(lán)色）與其最密切相關(guān)的蝙蝠病毒的分歧時(shí)間估計(jì)值（后中位數(shù)）。綠色箱線圖顯示了 RaTG13/SARS-CoV-2 譜系及其最密切相關(guān)的穿山甲譜系的 TMRCA 估計(jì)值（Guangdong 2019）东囚。箱線圖顯示四分位距跺嗽，白線是中位數(shù)，箱線圖顯示后驗(yàn)分布的全范圍页藻。四分位間距寬度和具有相同顏色的透明帶被疊加以突出估計(jì)之間的重疊桨嫁。
