1. 氧化磷酸化
2. 線粒體呼吸鏈
3. 氧化磷酸化抑制劑
3.1 線粒體呼吸抑制劑
3.2 磷酸化抑制劑
3.3 解偶聯(lián)劑
4. Seahorse
Seahorse能量代謝分析儀是一種用于測(cè)量細(xì)胞能量代謝的儀器森逮，可以通過測(cè)量細(xì)胞的耗氧率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）來評(píng)估細(xì)胞的線粒體功能窘拯、糖酵解和氧化磷酸化等過程沟绪。
OCR（Oxygen Consumption Rate）：OCR是指細(xì)胞對(duì)氧氣的消耗速率磷瘤。Seahorse能量代謝分析儀通過測(cè)量細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中的溶解氧含量的變化來確定OCR。在測(cè)量過程中题涨，細(xì)胞被置于特定的耗氧試劑中株搔，如噻唑類化合物（例如，琥珀酸肿男、馬拉酸和氰化鈉）介汹。這些試劑會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的線粒體呼吸鏈相互作用，導(dǎo)致氧氣消耗速率的變化舶沛。Seahorse能量代謝分析儀通過測(cè)量耗氧試劑與細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中溶解氧含量的變化嘹承，計(jì)算細(xì)胞的OCR。
ECAR（Extracellular Acidification Rate）：ECAR是指細(xì)胞外酸化速率如庭，也可以理解為細(xì)胞產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物的釋放速率叹卷。Seahorse能量代謝分析儀通過測(cè)量培養(yǎng)基中pH值的變化來確定ECAR。在測(cè)量過程中坪它，細(xì)胞被置于特定的酸化試劑中骤竹，如葡萄糖和丙酮酸鹽。這些試劑會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞糖酵解過程中乳酸的產(chǎn)生往毡，從而引起培養(yǎng)基pH值的變化蒙揣。Seahorse能量代謝分析儀通過測(cè)量培養(yǎng)基中pH值的變化，計(jì)算細(xì)胞的ECAR开瞭。
OCR和ECAR的測(cè)量原理：
4.1 OCR
（A）基礎(chǔ)呼吸（Basal respiration）：用于滿足細(xì)胞的 ATP 需求和質(zhì)子漏的耗氧鸣奔。代表細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下的能量需求。
（B）第一次加藥——寡霉素（Oligomycin）：是一種抑制線粒體ATP合酶惩阶，即抑制呼吸鏈上的線粒體復(fù)合物V挎狸。該藥可以影響或降低通過ETC的電子流。加入oligo之后OCR從基礎(chǔ)呼吸降低的部分即為氧化磷酸化的耗氧率（ATP production）断楷。
此時(shí)余下的部分則是質(zhì)子滲漏造成的耗氧率锨匆。線粒體質(zhì)子漏（Proton Leak）是指在線粒體內(nèi)質(zhì)膜上存在的一種通透性蛋白通道，允許質(zhì)子從線粒體內(nèi)腔返回細(xì)胞質(zhì)冬筒，從而繞過線粒體ATP合酶（ATP synthase）恐锣。正常情況下，質(zhì)子在線粒體內(nèi)膜上形成質(zhì)子梯度舞痰，通過ATP合酶驅(qū)動(dòng)ADP和磷酸轉(zhuǎn)化為ATP土榴。然而，質(zhì)子漏會(huì)導(dǎo)致質(zhì)子梯度的損失响牛，減少ATP的產(chǎn)生效率玷禽。
質(zhì)子漏可以通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜上的蛋白通道來發(fā)生赫段。一個(gè)重要的質(zhì)子漏通道是線粒體內(nèi)膜上的UCP（uncoupling protein）家族蛋白。UCP通道可以被激活矢赁，使質(zhì)子通過線粒體內(nèi)膜糯笙，而不經(jīng)過ATP合酶。這樣一來撩银，質(zhì)子梯度的能量將被釋放為熱量给涕，而不是用于ATP合成。質(zhì)子漏的發(fā)生可以增加線粒體呼吸過程中產(chǎn)生的熱量额获，并影響細(xì)胞能量代謝和體溫調(diào)節(jié)够庙。
質(zhì)子漏可作為線粒體損傷的標(biāo)志，也可被認(rèn)為是調(diào)節(jié)線粒體ATP合成的一種機(jī)制抄邀。
（C）第一次加藥后下降——ATP合成（ATP production, ATP-linked respiration）：加入oligomycin后產(chǎn)生的耗氧下降部分耘眨，占基礎(chǔ)呼吸耗氧的一部分，用于驅(qū)動(dòng)ATP合成撤摸。代表線粒體滿足細(xì)胞能量需求的ATP合成能力。
（D）第二次加藥——FCCP：是一種線粒體解偶聯(lián)劑褒纲，加入該藥會(huì)破壞質(zhì)子梯度和線粒體膜電位准夷，引起電子在 ETC不受限制地傳遞，同時(shí)復(fù)合物Ⅳ的耗氧達(dá)到最大莺掠。FCCP 刺激的 OCR可被用來計(jì)算細(xì)胞備用呼吸能力（該值為最大呼吸與基礎(chǔ)呼吸的差值）衫嵌，備用呼吸能力代表細(xì)胞對(duì)能量需求增加或在壓力下作出反應(yīng)的能力。
（E）第二次加藥后上升——最大耗氧量（maximal respiration）：加入FCCP后獲得的細(xì)胞最大耗氧彻秆。FCCP通過刺激細(xì)胞呼吸鏈以最大能力工作楔绞，來模擬一種生理上的“能量需求”，這引起了底物（糖唇兑、脂肪酒朵、氨基酸）的快速氧化以應(yīng)對(duì)這種代謝挑戰(zhàn)。代表了細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)的最大呼吸速率扎附。
（F）第三次加藥——魚藤酮（rotenone）& 抗霉素A（antimycin A）：第三次加入的藥物蔫耽，是rotenone和antimycin A的混合物。Rotenone是復(fù)合物Ⅰ的抑制劑留夜，antimycin A是復(fù)合物Ⅲ的抑制劑匙铡。這兩種藥物可關(guān)閉線粒體呼吸，從而能夠計(jì)算出由線粒體之外活動(dòng)所驅(qū)動(dòng)的非線粒體呼吸耗氧碍粥。
（G）第三次加藥后下降：①呼吸潛力（spare respiratory capacity）：最大呼吸減去基礎(chǔ)呼吸的耗氧鳖眼。代表細(xì)胞對(duì)能量需求的潛在響應(yīng)能力以及細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸與理論呼吸最大值間的差距，細(xì)胞響應(yīng)需求的能力可作為細(xì)胞適應(yīng)性或靈活性的指標(biāo)嚼摩。②non-mitochondrial oxygen consumption： 加入rotenone和antimycin A后仍持續(xù)的耗氧钦讳，這是由一部分細(xì)胞酶繼續(xù)耗氧產(chǎn)生的矿瘦。該參數(shù)對(duì)于精確測(cè)量線粒體呼吸功能非常重要。
4.2 ECAR
（A）第一次加藥——Glucose：實(shí)驗(yàn)第一次加入的藥物是飽和濃度的葡萄糖蜂厅，細(xì)胞通過糖酵解途徑利用該葡萄糖并將其分解為 pyruvate匪凡，產(chǎn)生 ATP、NADH掘猿、水和質(zhì)子病游。質(zhì)子釋放入胞外環(huán)境引起 ECAR 的迅速升高，這種由葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答被稱為細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下的糖酵解能力稠通。
（B）第一次加藥后的上升——Glycolysis：葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的過程衬衬，本實(shí)驗(yàn)中加入飽和濃度葡萄糖后細(xì)胞達(dá)到的 ECAR值，反映細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下的糖酵解能力改橘。
（C）第二次加藥——Oligomycin：實(shí)驗(yàn)第二次加入的藥物為oligomycin滋尉，其為ATP合酶的抑制劑，可抑制線粒體ATP產(chǎn)生飞主，從而將能量產(chǎn)生轉(zhuǎn)移至糖酵解通路狮惜，引起 ECAR 進(jìn)一步升高，反映了細(xì)胞最大的糖酵解能力碌识。
（D）第二次加藥后上升——酵解容量（Glycolytic capacity）：加入oligomycin后碾篡，細(xì)胞達(dá)到的最大ECAR值，指oligomycin有效關(guān)閉了氧化磷酸化功能后筏餐，迫使細(xì)胞利用糖酵解達(dá)到的最大產(chǎn)生能量的能力开泽。
（E）第三次加藥——2-DG（2-deoxy-glucose）：2-DG是最后加入的藥物，該藥通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合糖酵解途徑的己糖激酶而抑制糖酵解魁瞪，引起ECAR降低從而證實(shí)實(shí)驗(yàn)中ECAR的產(chǎn)生來源于糖酵解途徑穆律。
（F）第三次加藥后下降：①酵解儲(chǔ)備（Glycolytic reserve）：Glycolytic capacity 與 Glycolysis的差值， 反映了細(xì)胞滿足能量需求的能力导俘，以及糖酵解功能與細(xì)胞理論最大值之間的接近程度峦耘。②Non-glycolytic acidification：細(xì)胞外酸化的其他來源，非來自糖酵解途徑旅薄。
參考：
氧化磷酸化抑制劑和解偶聯(lián)劑
一文讀懂贡歧！Seahorse數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析——OCR、ECAR
