????????分享一下去年看過的一篇關(guān)于人SSC的文章：直譯就是“成人睪丸轉(zhuǎn)錄細(xì)胞圖譜”盯蝴，這篇文章主要是進(jìn)行的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析骡和，雖然是18年發(fā)的一篇文章说搅，但是也可以為我們的單細(xì)胞分析提供一點(diǎn)思路。
文章：The adulthuman testis transcriptional cell atlas
來源：Cell?Research (2018) 28:1141–1157; https://doi.org/10.1038/s41422-018-0099-2
?????? 說句題外話，這篇文章的作者今年又在Cell Stem Cell上發(fā)表了一篇青春期人睪丸發(fā)育動(dòng)態(tài)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜的文章（https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(19)30523-5）胡桃，也是作者在討論中提到的想要研究的方向，這篇文章沒仔細(xì)看磕潮，就講講上一篇文章翠胰。
——引言
????????先大概說一下背景容贝，人類精子發(fā)生涉及到成熟精原干細(xì)胞(SSCs)受睪丸生殖系微環(huán)境體細(xì)胞調(diào)節(jié)，在平衡其自我更新和分化后之景，通過一系列復(fù)雜發(fā)育過程分化為成熟精子。而當(dāng)前對(duì)人類精原干細(xì)胞及其調(diào)控的了解相對(duì)于小鼠研究而言還是比較少的，想要完全理解劲适，就需要整合分子狰住，基因組，蛋白質(zhì)組學(xué)和生理學(xué)方法轻纪。
????????對(duì)此油额，這篇文章的作者提出可以使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的方法來研究解決一些關(guān)于精原干細(xì)胞、分化精原細(xì)胞和配子發(fā)生的基本問題刻帚。例如：
????????What are themain molecular features that enable SSCs to serve as the longterm adultgermline stem cells?
????????使精原干細(xì)胞能夠作為長期成體生殖系干細(xì)胞的主要分子特征是什么潦嘶？
????????How do SSCstransition from their initial, most na?ve and quiescent states to spermatogoniathat will eventually commit to meiosis?
????????精原干細(xì)胞如何從最初的、最na?ve的和靜止的狀態(tài)過渡到最終會(huì)產(chǎn)生減數(shù)分裂的精原細(xì)胞崇众？
????????Are thesetransitions irreversible, or do spermatogonia possess bidirectional plasticitythat helps ensure a lifelong pool of SSCs?
????????這些轉(zhuǎn)變是不可逆的掂僵，還是精原細(xì)胞具有雙向可塑性，有助于確保終生的精原干細(xì)胞池顷歌？
????????Beyondspermatogonia, what are the subsequent sequential transcription and signalingprograms that accompany gametogenesis?
????????在形成精原細(xì)胞之后锰蓬，伴隨著配子發(fā)生的后續(xù)連續(xù)的轉(zhuǎn)錄和信號(hào)傳遞的程序是什么？
????????How are theseprocesses influenced by communication with niche cells—what are the specificsignaling and transcription pathways that regulate selfrenewal, proliferationrates, metabolism, and transitions between differentiation states?
????????與生殖系微環(huán)境體細(xì)胞的溝通如何影響這些過程眯漩，以及調(diào)節(jié)這一系列過程的特定信號(hào)和轉(zhuǎn)錄途徑又是什么互妓？
????????帶著這些問題，我們來看到作者所做的一些工作和得到的一些結(jié)論坤塞。
——正文內(nèi)容
????????首先這是這篇文章實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的來源冯勉，轉(zhuǎn)錄組測序和免疫染色的成人睪丸樣本來自17歲、24歲和25歲的三個(gè)健康男性摹芙，順序單分子RNA熒光原位雜交也就是mRNA seqFISH的樣本來自23歲的健康男性灼狰，用于轉(zhuǎn)錄組測序的嬰兒睪丸樣本來自兩個(gè)13個(gè)月大嬰兒捐贈(zèng)者。
????????作者對(duì)三個(gè)成人睪丸樣本都做了兩個(gè)單獨(dú)的技術(shù)重復(fù)浮禾，所以一共是得到六個(gè)數(shù)據(jù)集交胚。這六個(gè)數(shù)據(jù)集中總共捕獲約7000個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控后盈电，有6490個(gè)細(xì)胞用于下游分析蝴簇。
?????? 通過這個(gè)表可以看到獲得的細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞的平均reads數(shù)大約25W，每細(xì)胞中進(jìn)行分析的基因大約是2500個(gè)匆帚。測序飽和率>83%熬词，技術(shù)重復(fù)高度相似(r>0.96)。
?????? 然后作者通過Seurat 的TSNE分析將這些細(xì)胞劃分為13個(gè)群
?????? 而且可以看到不同批次或者細(xì)胞來源對(duì)分群的影響非常小，在每一個(gè)分群中都存在不同批次和來源的細(xì)胞的分布互拾。
????????然后根據(jù)已知的細(xì)胞類型markers的表達(dá)來鑒定各個(gè)分群細(xì)胞的類型歪今，作者通過不同分群的markers表達(dá)情況將9-13群分別定義為巨噬細(xì)胞macrophage，內(nèi)皮細(xì)胞endothelial颜矿，肌樣細(xì)胞myoid寄猩，支持細(xì)胞Sertoli和間質(zhì)細(xì)胞Leydig，這里只是個(gè)大致的markers表達(dá)情況骑疆，具體的特異markers后面會(huì)提到田篇。而生殖細(xì)胞系特異性markers僅在1-8群中表達(dá)，例如箍铭，DAZL和MAGEA4這兩個(gè)marker斯辰。此外，已知的SSC marker(例如UTF1坡疼，ID4和FGFR3)（1群）彬呻，分化marker(例如KIT和DMRT1)（2群differentiating spermatogonia），減數(shù)分裂marker(例如柄瑰，SYCP3闸氮，SPO11和MLH3)（3-4群primary spermatocytes），精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白marker(例如教沾，SPAG6蒲跨，ZPBP，CAMK4和CREM) (5-6群round spermatids)和核凝集或魚精蛋白重裝配因子marker(例如TNP1和PRM2)在1至8群中顯示了連續(xù)的表達(dá)情況授翻，這也就初步反映了配子發(fā)生在這些分群中的一個(gè)從1到8的時(shí)間順序或悲。
????????然后通過小提琴圖可以更直觀的看到markers在不同分群中的分布，同時(shí)可以看到一些人鼠表達(dá)方面的異同堪唐，先看一下生殖系微環(huán)境體細(xì)胞也就是9-13群的marker表達(dá)巡语，首先是第9群睪丸巨噬細(xì)胞，睪丸巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)精原細(xì)胞的維持淮菠，并特異性表達(dá)CD14男公，CD163，C1QA這幾個(gè)marker合陵。之前的一篇文章(Yang, Q.-E., Kim, D.,Kaucher, A., Oatley, M. J. & Oatley, J. M. CXCL12–CXCR4 signaling isrequired for the maintenance of mouse spermatogonial stem cells.J. Cell.Sci. 126, 1009–1020 (2013))發(fā)現(xiàn)小鼠的支持細(xì)胞Sertoli通過分泌CXCR4的配體CXCL12來幫助維持CXCR4陽性的精原細(xì)胞群體枢赔。而這篇文章里面顯示在人類間質(zhì)細(xì)胞也就是第13群（Leydig）中觀察到編碼CXCL12的RNA，而CXCR4在巨噬細(xì)胞和精原細(xì)胞中都表達(dá)拥知，這可能表明這個(gè)配受體體系促進(jìn)了巨噬細(xì)胞和精原細(xì)胞在人類中的共定位踏拜。此外，CSF1的受體CSF1R在巨噬細(xì)胞中特異性表達(dá)低剔，而在小鼠中其表達(dá)僅限于精原細(xì)胞速梗。這也是人鼠marker表達(dá)不同的地方之一肮塞。
? ? ? ? 然后看到第10群的內(nèi)皮細(xì)胞Endothelial和第11群的肌樣細(xì)胞Myoid，內(nèi)皮細(xì)胞主要是高表達(dá)VWF 和 PECAM1這兩個(gè)marker镀琉，肌樣細(xì)胞主要高表達(dá)MYH11和ACTA2這兩個(gè)marker峦嗤，在這里能看到在第10群細(xì)胞中維持成年組織動(dòng)態(tài)平衡的Notch信號(hào)的受體NOTCH4和這三個(gè)下游信號(hào)因子(JAG1蕊唐，HES1和MAML1)被特異性上調(diào)屋摔，而且在這里對(duì)小鼠胎兒肌樣細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育很重要的Hedgehog信號(hào)途徑的受體(PTCH1，PTCH2)和下游信號(hào)成分(GLI和IGFBP6)在成年人類肌樣細(xì)胞(11群)和間質(zhì)細(xì)胞Leydig (13群)中也是高度表達(dá)替梨。表明這兩種信號(hào)活動(dòng)在人類睪丸中會(huì)持續(xù)到成年期钓试。
????????再看到第12群支持細(xì)胞Sertoli，支持細(xì)胞主要是表達(dá)SOX9和AMH這兩個(gè)marker副瀑，它還表達(dá)了一種在人類生精小管基底膜中發(fā)現(xiàn)的整合素的marker ITGA6弓熏，這里還注意到的是支持細(xì)胞還表達(dá)了WFDC2和PRND這兩種marker，WFDC2編碼一種可能促進(jìn)精子成熟的附睪蛋白糠睡，PRND則編碼一種糖基化磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白挽鞠，這種蛋白可能與生殖細(xì)胞的受體相互作用。
????????最后來看到第13群狈孔，特異表達(dá)DLK1和IGF1的睪丸間質(zhì)細(xì)胞Leydig信认，間質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)了一些特定marker，包括編碼IGF結(jié)合蛋白的markerIGFBP5均抽、IGFBP3嫁赏、抑制素和激活素（抑制素可增強(qiáng)促黃體生成素刺激未成熟間質(zhì)細(xì)胞生成睪酮的作用，另外,抑制素可調(diào)節(jié)精原細(xì)胞數(shù)量,研究顯示油挥，抑制素可使倉鼠和成年小鼠精原細(xì)胞數(shù)量減少潦蝇，也可使成年大鼠精子細(xì)胞數(shù)目減少，激活素對(duì)精原細(xì)胞增殖有很強(qiáng)的促進(jìn)作用深寥，且對(duì)支持細(xì)胞有絲分裂有促進(jìn)作用）的亞基marker INHBA攘乒，以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的marker VIT。
????????然后看到一些通路的表達(dá)情況惋鹅，在這里作者發(fā)現(xiàn)睪酮生物合成的關(guān)鍵基因STAR和HSD17B3在12群支持細(xì)胞Sertoli和13群間質(zhì)細(xì)胞Leydig中都有表達(dá)持灰，而他們的反應(yīng)基因SHBG和SRD5A2在成熟精子中表達(dá)。
????????維甲酸(RA)誘導(dǎo)生殖細(xì)胞分化负饲，維甲酸合成酶的marker ALDH1A1和ALDH1A3在13群間質(zhì)細(xì)胞Leydig和11群肌樣細(xì)胞myoid中特異性表達(dá)堤魁；而維甲酸靶基因STRA8僅在精原細(xì)胞向精母細(xì)胞轉(zhuǎn)變期間觀察到。
????????此外作者還發(fā)現(xiàn)WNT配體WNT2B主要在11群肌樣細(xì)胞Myoid中表達(dá)返十，而WNT2B受體主要表達(dá)于初級(jí)精母細(xì)胞妥泉，這大概表明WNT2B在人類減數(shù)分裂中起作用。
????????然后PDGFB在第10群內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)洞坑，其受體PDGFRA和PDGFRB在13群間質(zhì)細(xì)胞Leydig和11群肌樣細(xì)胞Myoid中發(fā)現(xiàn)盲链，表明內(nèi)皮細(xì)胞可能通過與其他微環(huán)境體細(xì)胞的串?dāng)_機(jī)制間接影響生殖細(xì)胞的發(fā)育。綜上所述，作者得到的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了人類和小鼠在生殖系-微環(huán)境相互作用方面的相似性和顯著差異刽沾，當(dāng)然這些都還需要進(jìn)一步的詳細(xì)功能研究本慕。
?????? 前面作者通過markers鑒定認(rèn)為，生殖細(xì)胞的發(fā)育順序是由1-8群這么一個(gè)波浪狀的連續(xù)過程侧漓，來概括精子發(fā)生的時(shí)間順序锅尘，作者通過偽時(shí)間分析得到的這個(gè)時(shí)序也印證了這一點(diǎn)。
????????同時(shí)按照偽時(shí)間分析得到的時(shí)序進(jìn)行樣本的基因聚類分析布蔗，這里可以看到作者將生殖細(xì)胞系的樣本聚類成12個(gè)不同的基因隊(duì)列藤违，通過GO分析發(fā)現(xiàn)也是印證了之前預(yù)想的比如說分化、減數(shù)分裂纵揍、精子最終形成的這種精子發(fā)生的發(fā)育順序顿乒。
????????然后作者又對(duì)這八個(gè)分群進(jìn)行連續(xù)的差異分析，確定了一系列差異表達(dá)基因泽谨，通過GO分析發(fā)現(xiàn)正如作者所預(yù)期的璧榄，上下調(diào)的基因中比較顯著的是諸如“細(xì)胞周期”、“減數(shù)分裂”和“精子發(fā)生”（‘cell cycle’, ‘meiosis’ and ‘spermatogenesis’）的這類基因吧雹。而且在這里能發(fā)現(xiàn)在從精母細(xì)胞到圓形精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程中骨杂，差異表達(dá)的基因是最多的，說明在這個(gè)過程中轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化是最大的吮炕。
????????同時(shí)作者還查看了一些轉(zhuǎn)座因子(TE)和長非編碼RNA(LncRNAs)在生精過程中的表達(dá)情況(高等生物中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子源(retrotransposon)分為病毒家族和非病毒家族兩類腊脱，前者為LTR(long terminal repeats)，有稱為長末端重復(fù)龙亲，后者為SINE（short interspersed nuclear elements）和LINE（long interspersed nuclear elements）陕凹，稱為長散布重復(fù)序列與短散布重復(fù)序列（又稱非長末端重復(fù)序列的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子）。)鳄炉，發(fā)現(xiàn)LTR12C/D/E和活性轉(zhuǎn)座因子SVA_D和AluYa5在生精早期高表達(dá)杜耙。相比較而言，LTR10a和LTR40c在精原細(xì)胞晚期或減數(shù)分裂后的時(shí)期高表達(dá)拂盯，而Satellite和多個(gè)MLT家族轉(zhuǎn)座因子在精細(xì)胞和精子階段表達(dá)佑女。
????????此外，作者還探索了精子發(fā)生過程中X染色體失活和減數(shù)分裂性染色體失活(（Meiotic sex chromosome inactivation谈竿，MSCI）：發(fā)生在雄性減數(shù)分裂過程中团驱，影響大多數(shù)或所有XY基因表達(dá)并導(dǎo)致形成濃縮的XY小體，MSCI的紊亂導(dǎo)致毒性基因錯(cuò)誤表達(dá)和中粗線期生殖細(xì)胞死亡空凸。)嚎花。作者觀察到XIST在精原細(xì)胞階段表達(dá)(圖S4C、D)呀洲，并且在精原階段X失活中心附近的基因表達(dá)出現(xiàn)衰減(圖.S4E紊选、F)啼止，表明XIST介導(dǎo)的沉默在這一過程中起作用。
????????接下來兵罢，作者挑出了第三和第四群献烦，也就是之前定義的減數(shù)分裂時(shí)期的初級(jí)精母細(xì)胞，進(jìn)行了重新聚類卖词，分出了5個(gè)子群巩那。
????????并通過偽時(shí)間分析和使用已知的marker，指定了前細(xì)線期坏平，細(xì)線期拢操，偶線期或早期粗線期锦亦，晚期粗線期和雙線期細(xì)胞類型舶替。其中次級(jí)精母細(xì)胞表達(dá)不足，判斷與它們迅速發(fā)展為圓形精子細(xì)胞有關(guān)杠园。
????????基因聚類分析鑒定出五個(gè)不同的分子標(biāo)記包含4594個(gè)基因顾瞪，表明轉(zhuǎn)錄變化在進(jìn)入減數(shù)分裂和退出減數(shù)分裂的過程中比較明顯，但減數(shù)分裂期間變化較為平緩抛蚁。這里作者特別提到陈醒，一些RNA結(jié)合蛋白marker在偶線期或早期粗線期上調(diào)，一些HOX基因(例如HOXB4和HOXC6)在晚期粗線期特異性表達(dá)瞧甩。
????????同時(shí)作者觀察到DMRT和SOX家族成員的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式：DMRT1和SOX4僅在前細(xì)線期細(xì)胞中表達(dá)钉跷，這與它們?cè)谛∈鬁p數(shù)分裂過程中進(jìn)入抑制狀態(tài)的作用是一致的。雖然DMRTC2和DMRT3的功能在很大程度上尚不清楚肚逸，但Sox30基因敲除可導(dǎo)致小鼠生殖細(xì)胞發(fā)育停滯在圓形精子細(xì)胞階段爷辙，并降低Sox5的表達(dá)‰伲總體而言膝晾，這個(gè)數(shù)據(jù)與小鼠的發(fā)現(xiàn)是一致的，但也為在減數(shù)分裂期間具有人類特異性功能的候選基因提供了證據(jù)务冕。
????????為了進(jìn)一步描述精原的具體狀態(tài)血当，作者重新聚類了早期生殖細(xì)胞的1-2兩群。該分析產(chǎn)生了五個(gè)不同的分群：雖然其中四個(gè)群state1-4顯示出與先前描述的分群或狀態(tài)高度相似禀忆，但此后識(shí)別出了一個(gè)額外的分群臊旭，這個(gè)分群被稱為State0。偽時(shí)間分析揭示了從State0到state4的波狀進(jìn)展箩退，
????????并且通過聚類分析定義了與每個(gè)狀態(tài)相關(guān)的基因表達(dá)特征离熏。值得注意的是，作者觀察到State1和State2之間轉(zhuǎn)錄程序的顯著轉(zhuǎn)變乏德，主要是細(xì)胞周期或增殖基因的表達(dá)(例如撤奸，MKI67)吠昭，這表明這種轉(zhuǎn)變代表了一個(gè)關(guān)鍵的發(fā)育節(jié)點(diǎn)(見Discussion)。
????????雖然State0和State1細(xì)胞共同表達(dá)許多關(guān)鍵的干細(xì)胞信號(hào)因子和轉(zhuǎn)錄因子（TF）(圖5c胧瓜，d)矢棚，
????????但作者的分析鑒定了State0中最高表達(dá)或特異性表達(dá)的490個(gè)基因(例如，PIWIL4府喳，EGR4蒲肋，TSPAN33，PHGDH钝满，PPP1R36兜粘，ICA1L(圖5e，f))弯蚜。已知的早期SSC marker(ID4孔轴，F(xiàn)GFR3，TCF3和UTF1)在State0和1中表達(dá)碎捺，而已知的分化marker KIT 或增殖marker MKI67 在State 2或之后特異表達(dá)路鹰，表明State0和State1可能代表兩種不同的靜止SSC狀態(tài)。
????????而且這里大多數(shù)State 0細(xì)胞顯示出ST3GAL2的低表達(dá)收厨，這個(gè)marker是一種催化SSEA4形成的酶(圖S5g)晋柱，表明State0細(xì)胞不表達(dá)SSEA4這種精原細(xì)胞表面marker。
????????接下來诵叁，作者應(yīng)用一種新的RNA速度算法（‘velocity’ R包）來推斷發(fā)育軌跡雁竞。這個(gè)算法通過與其他細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，可以定義表示每個(gè)單獨(dú)細(xì)胞的未來轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的速度矢量拧额。在tSNE圖(圖6A)的每個(gè)細(xì)胞內(nèi)碑诉，這個(gè)矢量的幅度和方向反映了轉(zhuǎn)錄軌跡。這一分析揭示了兩個(gè)意想不到的特征势腮。首先联贩，在State0集群內(nèi)，可以觀察到兩個(gè)亞群：一個(gè)靠近State1捎拯，攜帶較長的矢量箭頭泪幌，表明向著State 1的明顯進(jìn)展，而另一個(gè)亞群都是攜帶比較短的矢量箭頭署照。這種模式表明祸泪，下面這一個(gè)細(xì)胞亞群正在積極地向State1發(fā)展，以響應(yīng)特定的發(fā)育信號(hào)建芙，而上面這一個(gè)細(xì)胞亞群沒有没隘。
????????其次，還可以觀察到State2細(xì)胞的亞群有一些顯示指向State 1的長速度矢量禁荸。State0-1-2之間的這種向前和向后的運(yùn)動(dòng)右蒲，增加了人類精原細(xì)胞具有動(dòng)態(tài)可塑性的可能性阀湿。
????????然后作者開始探索甲基化或染色質(zhì)狀態(tài)是否可以提供進(jìn)一步的可塑性證據(jù)。首先瑰妄，盡管剛才提到過的超過8000個(gè)基因在精原發(fā)育和精子發(fā)生過程中表現(xiàn)出差異表達(dá)(圖3B)陷嘴，但作者說他觀察到SSEA4富集的人類SSCs和成熟人類精子的DNA甲基化譜幾乎沒有差異-這與在小鼠中的類似發(fā)現(xiàn)相似。因此间坐，作者推斷不存在可能阻止精原細(xì)胞去分化的DNA甲基化屏障灾挨。接下來，作者從分化的精原細(xì)胞中使用c-KIT富集分離出開放染色質(zhì)竹宋，并將其與用SSEA4富集的自我更新的SSCs圖譜進(jìn)行比較(圖6B)劳澄。可以看到蜈七，c-KIT和SSEA4富集的精原細(xì)胞的開放染色質(zhì)圖譜是高度相似的(r>0.83)秒拔，并且它們最近的peak峰通常是重疊的(距離約120bp)，這表明盡管存在數(shù)百個(gè)基因的激活和抑制宪潮，但在未分化的SSEA4陽性SSCs轉(zhuǎn)變到分化的c-kit陽性精原細(xì)胞的過程中溯警，開放染色質(zhì)格局幾乎沒有發(fā)生變化趣苏。
????????綜上所述狡相，轉(zhuǎn)錄組分析、RNA速度趨勢和來自開放染色質(zhì)景觀以及DNA甲基化分析的證據(jù)都指向這么一個(gè)假設(shè)食磕，即SSCs遵循一個(gè)涉及5種順序轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的發(fā)育過程尽棕，該過程的特點(diǎn)是染色質(zhì)或DNA甲基化景觀是一個(gè)比較穩(wěn)定的狀態(tài)，這強(qiáng)烈暗示了精原細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為(圖6C)彬伦。
????????為了評(píng)估這個(gè)State0是否代表成人中最naive的SSC滔悉，作者還分析了來自12-13個(gè)月大嬰兒的睪丸細(xì)胞。經(jīng)過質(zhì)控過濾单绑，獲得了約1300個(gè)單細(xì)胞回官，并根據(jù)已知markers分配了細(xì)胞類型。這項(xiàng)分析確定了四種體細(xì)胞類型（巨噬細(xì)胞Macrophage搂橙，內(nèi)皮細(xì)胞Endothelial歉提，支持細(xì)胞Sertoli和間質(zhì)細(xì)胞Leydig）(圖7A，b区转；補(bǔ)充信息苔巨，圖。S7)废离，以及一個(gè)由37個(gè)生殖細(xì)胞組成的分群類型侄泽。
????????通過tSNE和偽時(shí)間分析與成人SSC狀態(tài)進(jìn)行比較，將嬰兒生殖細(xì)胞定位在與成人State0相鄰的位置蜻韭，處于發(fā)育軌跡的“起點(diǎn)”(圖7C)悼尾。此外柿扣，大多數(shù)State0 markers在嬰兒生殖細(xì)胞中高度表達(dá)(圖7D)。一小部分因子(例如TBX3闺魏，HOXA3)在嬰兒精原細(xì)胞中顯示出特異性表達(dá)窄刘，這可能指定它們的種系身份。此外舷胜，嬰兒體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)應(yīng)該能為將來的分析提供有用的資源娩践。
????????另外作者對(duì)5個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行了順序單分子RNA熒光原位雜交(SeqFISH)(圖8A；補(bǔ)充信息烹骨，表S6)翻伺。發(fā)現(xiàn)在中/高度表達(dá)TCF3的細(xì)胞，也就是STATE 0和STATE 1的細(xì)胞中沮焕，只有27%(9/33)的細(xì)胞同時(shí)高表達(dá)STATE 0的marker (PIWIL4)和STATE 1的marker (ETV5/L1TD1)吨岭，其余的細(xì)胞只表達(dá)兩者之一。這在STATE 0和STATE 1的marke之間產(chǎn)生了顯著的不重疊(超幾何檢驗(yàn)峦树；p=0.03)辣辫，驗(yàn)證了之前的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果。
????????然后作者試圖使用細(xì)胞表面marker來富集State 0細(xì)胞魁巩，并評(píng)估它們的SSEA4狀態(tài)急灭。在這里，作者使用了TSPAN家族受體TSPAN33谷遂，它在State0中有很強(qiáng)的富集效應(yīng)葬馋。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)高水平表達(dá)SSC marker FGFR3的細(xì)胞(圖5D)的分析表明，F(xiàn)GFR3高表達(dá)的細(xì)胞同時(shí)高表達(dá)TSPAN33但SSEA4的表達(dá)量比較低(圖8B)肾扰，因此作者將State 0表述為具有FGFR3和TSPAN33共定位高表達(dá)但SSEA4表達(dá)量低的特征畴嘶。
????????此外作者還想通過蛋白免疫熒光法原位觀察SSC早期狀態(tài)，作者通過三重免疫熒光(IF)染色鑒定了早期精原markers(UTF1集晚、GFRA1窗悯、FGFR3和TCF3)的蛋白表達(dá)，這些markers在早期狀態(tài)State 0-1-2中表現(xiàn)出差異表達(dá)偷拔。UTF1的表達(dá)量在State 0最高蒋院，并且與只在State 1的表達(dá)量最高的GFRA1部分重疊(圖5D)。
????????作者觀察到有大約66%位于生精小管外圍的細(xì)胞表達(dá)UTF1或GFRA1条摸，這和前面的分析是吻合的悦污。在這里，能夠區(qū)分出兩種大概的精原細(xì)胞表型钉蒲，分別是高表達(dá)UTF1 /低表達(dá)GFRA1和低表達(dá)UTF1/高表達(dá)GFRA1兩種類型切端，它們大致概括了從State 0到State 1的時(shí)間進(jìn)程。正如作者預(yù)期的那樣顷啼，增殖marker MKI67與GFRA1或者UTF1幾乎沒有重疊(圖8c和未顯示的數(shù)據(jù))踏枣，表明向增殖過程State 2的轉(zhuǎn)變是發(fā)生在SSC的marker丟失的情況下的昌屉，這也和之前的分析(圖5和6c)是一致的。
????????最后茵瀑，作者進(jìn)一步鑒定了State 0和State 1的特異性基因的表達(dá)间驮。利用人類蛋白質(zhì)圖譜資源(http://www.proteinatlas.org/))回顧了490個(gè)State 0基因的模式，選擇了16個(gè)在生精小管周邊細(xì)胞中特異表達(dá)的候選早期SSC markers马昨。UTF1和GFRA1三重免疫熒光(IF)染色顯示竞帽，這16個(gè)markers均在GFRA1陽性或UTF1陽性細(xì)胞中表達(dá)。正如轉(zhuǎn)錄組分析預(yù)測的那樣鸿捧，PHGDH和PPP1R36的抗體在UTF1高表達(dá)細(xì)胞也就是State 0的細(xì)胞中熒光比較強(qiáng)(圖8D)屹篓。
????????這里能觀察到很多State 0的markers顯示在State 1 marker標(biāo)記的細(xì)胞中表達(dá)(圖8D；補(bǔ)充信息匙奴，圖S8b)堆巧，作者判斷這可能是因?yàn)樵赟tate 0時(shí)期細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)的RNA(例如，UTF1)產(chǎn)生一種半衰期比其RNA更長的蛋白質(zhì)泼菌，因此該蛋白質(zhì)持續(xù)進(jìn)入State 1時(shí)期谍肤。此外，作者觀察到有一些marker與UTF1或GFRA1共同高表達(dá)的細(xì)胞在染色強(qiáng)度或亞核定位方面存在差異(圖8D哗伯；補(bǔ)充信息荒揣，圖S8b)。作者認(rèn)為這是因?yàn)殡m然在轉(zhuǎn)錄的定義上State 0和State 1是一個(gè)離散的狀態(tài)笋颤，但它們可能代表的是相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)或者是異質(zhì)的細(xì)胞表型乳附，這種狀態(tài)使得SSCs能夠適應(yīng)動(dòng)態(tài)的生殖系體細(xì)胞微環(huán)境，并確保睪丸內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)伴澄。
——SUMMARY
????????總體而言，作者在這篇文章中通過對(duì)大約6500個(gè)成人的睪丸細(xì)胞進(jìn)行分析及與其他數(shù)據(jù)的比較阱缓，起到了以下幾個(gè)作用：
1非凌、Reportednew data that reveal potential differences between mice and men, and changesduring development, for future functional investigation.
????????首先作者提供的數(shù)據(jù)揭示了小鼠和人之間的潛在差異，以及發(fā)育過程中的變化荆针，這可以用于未來的功能研究敞嗡。
2、Providedseveral new insights into spermatogonial development, most importantly theidentification of a novel and early quiescent state, termed State 0.
????????然后作者還提供了幾個(gè)精原發(fā)育的新見解航背，最重要的是確定了一種新的早期的靜止?fàn)顟B(tài)喉悴，稱為State 0，并通過與嬰兒生殖細(xì)胞進(jìn)行比較玖媚，認(rèn)為State 0細(xì)胞代表成人生殖系中一直由嬰兒時(shí)期維持到成人時(shí)期的未分化和靜止的“儲(chǔ)備”干細(xì)胞庫箕肃。
3、Providedtwo lines of evidence consistent with developmental plasticity in early humanspermatogonia.
????????此外作者也提出了兩條人類早期精原細(xì)胞可塑性的證據(jù)今魔，一是RNA速度分析挑出了一組State 2的精原細(xì)胞勺像，它傾向于“去分化”成State 1狀態(tài)的細(xì)胞障贸。而且從State 1到State 2的轉(zhuǎn)變過程中增殖marker上調(diào)，這可能正是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)吟宦。二是作者觀察到精原細(xì)胞發(fā)育軌跡上開放染色質(zhì)和DNA甲基化的變化非常有限篮洁，這說明可能可以通過降低表觀遺傳障礙以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的改變和去分化，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的可塑性殃姓。
