Single cell transcriptome analysis reveals disease-defining T cell ?subsets in the tumor microenvironment of classic Hodgkin lymphoma

19年12月在線發(fā)表在Cancer Discovery上的單細(xì)胞文章

doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0680

Highlight

?Identified a novel HL-associated subset of T cells with prominent expression of the inhibitory receptor LAG3.

?Multiplexed spatial assessment of immune cells in the microenvironment also revealed increased LAG3+ T cells in the direct vicinity of MHC class-II deficient tumor cells.

?Provide novel insights into TME biology and suggest new approaches to immune checkpoint targeting in HL.

????單細(xì)胞表達(dá)譜鑒定了一個新的霍奇金淋巴瘤相關(guān)的T細(xì)胞亞群，該亞群具有顯著的抑制性受體LAG3的表達(dá)，并對其進(jìn)行了功能分析届慈。對微環(huán)境中免疫細(xì)胞的空間估算也顯示，在MHC二類缺陷腫瘤細(xì)胞的附近呢袱，LAG3陽性T細(xì)胞增加。研究結(jié)果為腫瘤微環(huán)境提供了新的見解，并為霍奇金淋巴瘤靶向免疫檢查點提供了新的方法遥赚。

Results

Fig1.Immunecell atlas of the Hodgkin lymphoma microenvironment at?single-cellresolution.

????為了研究霍奇金淋巴瘤里免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)疏咐，作者選擇了22個經(jīng)典霍奇金淋巴瘤患者的淋巴結(jié)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序纤掸，包括12個NS亞型，9個MC亞型浑塞，和一個LR亞型,也對5個正常人的淋巴結(jié)進(jìn)行了單細(xì)胞測序借跪。根據(jù)已知的marker的表達(dá)情況，作者將免疫細(xì)胞分成了22個亞型酌壕。但是并沒有發(fā)現(xiàn)HRS細(xì)胞掏愁。

? ??作者發(fā)現(xiàn)所有的三個treg cluster的來源組成中都只有一小部分是來源于正常組織歇由。并對Treg的細(xì)胞來源比例做了t-test檢驗，發(fā)現(xiàn)淋巴瘤患者中的Treg顯著高于正常人托猩。在這三個Treg cluster中印蓖，細(xì)胞來源于淋巴瘤患者最多比例的是C5，呈現(xiàn)出LAG3和CTLA4的高表達(dá)京腥。并且作者發(fā)現(xiàn)在非Treg的CD4細(xì)胞中赦肃，主要由Th2細(xì)胞組成，Th1和Th17細(xì)胞在淋巴瘤患者中顯著高于正常人公浪。

????由于40%的經(jīng)典霍奇金淋巴瘤與EBV感染惡性HRS細(xì)胞相關(guān)他宛，并且有研究表明EBV可以在霍奇金淋巴瘤的腫瘤微環(huán)境中募集Treg細(xì)胞。所以作者比較了5位EBV陽性和17位EBV陰性患者的RNA測序數(shù)據(jù)欠气。發(fā)現(xiàn)在EBV陽性腫瘤中Th17細(xì)胞顯著降低厅各。在Treg和CD8陽性T細(xì)胞中并沒有發(fā)現(xiàn)差異。相似的是预柒，與結(jié)節(jié)硬化的NS亞型相比队塘，與EBV更相關(guān)的混合型MC亞型Th17細(xì)胞比例更低。

Fig2.Detailedcharacterization and co-expression patterns of regulatory T cells?in thetumor microenvironment of classicHodgkin Lymphoma.

????本研究中已經(jīng)得到Treg細(xì)胞在腫瘤中占比更多宜鸯，并且考慮到免疫抑制的腫瘤微環(huán)境作為腫瘤標(biāo)志的重要性憔古，作者將研究重點放在了Treg細(xì)胞中。尤其是腫瘤占比最高的C5淋袖。在C5中高表達(dá)LAG3和其他的經(jīng)典Treg marker鸿市，比如IL2RA和TNFRSF18.但是也有一些經(jīng)典marker比如FOXP3在這個cluster里并不共表達(dá)，暗示這群細(xì)胞是一型T reg細(xì)胞即碗。為了更深入研究免疫抑制受體表達(dá)的特點焰情，進(jìn)一步研究了T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LAG3表達(dá)的細(xì)胞多來自Treg剥懒，PD-1表達(dá)的細(xì)胞多少非Treg的CD4陽性T細(xì)胞内舟，而且CD8細(xì)胞不是LAG3和PD1表達(dá)最高的細(xì)胞類型，說明CD4的再免疫檢查點調(diào)節(jié)中作用更大初橘。

????從圖D中也可以看出這幾種免疫細(xì)胞LAG3和PD1的表達(dá)情況验游。接著在圖E中展示了在不同的T細(xì)胞亞型中免疫抑制受體的的表達(dá)變化，說明每種免疫抑制受體在不同的T細(xì)胞亞型中的獨(dú)特作用壁却。并且在圖F中可以看出大部分的LAG3陽性T細(xì)胞和CTLA4共表達(dá)，而不是PD1裸准。為了探索LAG3陽性T細(xì)胞的功能展东，研究人員用所有的CD4T細(xì)胞根據(jù)分化狀態(tài)繪制了Diffusion map。Dimension1從naiveT開始到Treg結(jié)束炒俱，LAG3陽性T細(xì)胞富集在這個維度的尾部盐肃，和終端分化的特征的基因相關(guān)爪膊。之前有報道稱LAG3陽性T細(xì)胞通過顯著抑制增殖活性來表達(dá)其免疫抑制的活性。而且LAG3陽性T細(xì)胞在Dimension2中處于中間到結(jié)束的部分砸王，這個維度是和細(xì)胞周期和糖酵解相關(guān)聯(lián)的推盛。總之這個圖提供了LAG3陽性的細(xì)胞具有增殖活性下降的依據(jù)谦铃。

Figure3. An immune suppressive microenvironment is characteristic of cHLand?is associated with LAG3 positivity.

????為了判定在經(jīng)典霍奇金淋巴瘤中Treg的免疫抑制特征耘成，研究人員調(diào)查令LAG3陽性T細(xì)胞中的細(xì)胞因子的表達(dá)。用單細(xì)胞數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在LAG3陽性T細(xì)胞也就是藍(lán)色代表的部分中免疫抑制的細(xì)胞因子IL10,TGFβ驹闰，IFNγ等表達(dá)比陰性也就是紅色部分更高瘪菌。這點和一型Treg細(xì)胞表達(dá)相近。為了研究LAG3陽性T細(xì)胞免疫抑制的表型嘹朗，研究人員做了一系列實驗驗證师妙。首先評估了不同淋巴瘤細(xì)胞系培養(yǎng)的上清液對T細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響。將PBMC和經(jīng)典霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系和彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)還有單純培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照等屹培。圖B為經(jīng)典霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系L1236共培養(yǎng)和單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的T細(xì)胞流式圖默穴，證明淋巴瘤中的LAG3陽性細(xì)胞確實比普通的CD4T細(xì)胞中比例高。圖C也能說明在霍奇金淋巴瘤中LAG3T陽性T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和對照褪秀。

????研究人員使用液相芯片技術(shù)測得和霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)的的上清中有比彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的顯著高表達(dá)的TARC蓄诽，CCL17，TGFβ溜歪，IL6等已知的Treg遷移和分化的細(xì)胞因子若专。和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，通過流式分選出來的CD4陽性LAG3陽性的T細(xì)胞分泌的IL10 和TGFβ顯著高于LAG3陰性的T細(xì)胞蝴猪。通過F圖可以看出在體外共培養(yǎng)的時候调衰，CD4陽性LAG3陽性的T細(xì)胞抑制了responder CD4T細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步確定了LAG3陽性T細(xì)胞的免疫抑制作用自阱。

Figure4. Spatial distribution of Hodgkin and Reed-Sternberg cells and LAG3+T?cells in cHLtumors.

????接下來作者想要研究LAG3陽性T細(xì)胞與惡性HRS細(xì)胞在空間上的關(guān)系嚎莉。免疫組化證明了在經(jīng)典霍奇金淋巴瘤中LAG3陽性T細(xì)胞數(shù)量確實顯著高于正常淋巴結(jié)，并且在一部分霍奇金淋巴瘤中沛豌，HRS細(xì)胞被LAG3陽性細(xì)胞緊密包圍趋箩。值得注意的是，在單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中MHC二類陰性的HRS細(xì)胞的6位患者中的LAG3的表達(dá)顯著高于MHC二類陽性的16位患者加派。并且在MHC二類陰性患者和陽性患者的C5 treg細(xì)胞的差異基因?qū)Ρ戎薪腥罚琇AG3是最高表達(dá)的。作者還進(jìn)行了一系列免疫組化芍锦，染了很多marker 不僅說明LAG3在MHC二類陰性HRS細(xì)胞附近的T細(xì)胞中增高竹勉，也發(fā)現(xiàn)了FOXP3的降低。

????作者還估算了HRS細(xì)胞到LAG3陽性CD4陽性T細(xì)胞之間的空間關(guān)系娄琉，包括分布密度和平均的最短相鄰距離次乓，都進(jìn)行了量化吓歇，得到LAG3在MHC二類陰性HRS細(xì)胞附近的密度顯著高于MHC二類陽性，并且距離也更近票腰，然而FOXP3正好相反城看。通過多色免疫組化染色也能夠證明LAG3和MHC二類陰性HRS細(xì)胞間的關(guān)系。

Figure5. Co-expression patterns and localization of immune cells according to?HRS MHC-II status,? using imaging mass cytometry.

????為了進(jìn)一步研究HRS細(xì)胞和他們周圍細(xì)胞間的空間關(guān)系杏慰，研究人員選擇了IMC成像質(zhì)譜流式的方法测柠，能夠在腫瘤微環(huán)境中同時檢測和可視化35個蛋白質(zhì)標(biāo)記的空間環(huán)境。與免疫組化結(jié)果一致逃默，IMC也證明了MHC二類陰性的霍奇金淋巴瘤患者中LAG3陽性CD4陽性的細(xì)胞更多而且鹃愤，F(xiàn)OXP3陽性CD4陽性的細(xì)胞更少。最右側(cè)兩張圖是研究人員用算法將IMC的圖計算后得到更清晰的圖片完域。研究人員又?jǐn)U大了cohort软吐，在166名接受一線化療藥治療的患者的免疫組化中進(jìn)行驗證，將LAG3陽性細(xì)胞在腫瘤組織的比例在MHC二類陽性陰性的病例中比較吟税，得到結(jié)果與單細(xì)胞數(shù)據(jù)一致凹耙。MHC陰性患者中LAG3陽性細(xì)胞更多，而且與EBV的感染沒有關(guān)系肠仪。

????并且在大的cohort中發(fā)現(xiàn)了LAG3潛在的預(yù)后價值肖抱，但是P值不顯著。

Figure6. Interactions of HRS cells and CD4+ LAG3+ T cells.

????為研究HRS細(xì)胞與霍奇金淋巴瘤免疫微環(huán)境的聯(lián)系异旧，研究人員測得了顯微切割得到的MHC二類陰性和陽性的HRS細(xì)胞和來自扁桃體生發(fā)中心的GCB細(xì)胞中各種細(xì)胞因子和趨化因子的蛋白表達(dá)意述。其中IL6是一種一型Treg分化的promoter，也是唯一一個在MHC二類陰性陽性中有差異的細(xì)胞因子吮蛹。將PBMC分布和霍奇金淋巴瘤的細(xì)胞中共培養(yǎng)荤崇，在加入了IL6的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在只有培養(yǎng)基的細(xì)胞中培養(yǎng)潮针，獲得LAG3陽性T細(xì)胞在CD4陽性T細(xì)胞中的比例术荤，前兩者沒有差異，后兩者差異明顯每篷，說明IL6可以誘導(dǎo)CD4陽性LAG3陽性T細(xì)胞的生成瓣戚。

????已知MHC二類分子是LAG3的配體，為了研究LAG3陽性T細(xì)胞和HRS細(xì)胞中MHC二類分子的關(guān)系焦读。對CIITA進(jìn)行敲除子库，CIITA是MHC二類分子的主調(diào)節(jié)因子，已證實CIITA敲除細(xì)胞室MHC二類分子陰性的狀態(tài)矗晃。發(fā)現(xiàn)MHC二類分子陽性的野生型中LAG3表達(dá)顯著降低仑嗅，說明LAG3陽性T細(xì)胞功能受到MHC二類分子的負(fù)調(diào)控。

????之后研究人員想查看LAG3T細(xì)胞在病理中的作用，將從4位病人的T細(xì)胞和CD4无畔，LAG3，CD25陽性的T細(xì)胞體外共培養(yǎng)吠冤，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的增殖被抑制浑彰，增殖相關(guān)的細(xì)胞因子也被抑制。結(jié)果支持CD4陽性LAG3陽性的T細(xì)胞在經(jīng)典霍奇金淋巴瘤的臨床樣本中的免疫抑制作用拯辙，為以LAG 3陽性T細(xì)胞及其相互作用為靶點郭变，促進(jìn)一部分患者T細(xì)胞的活化提供了臨床前的理論基礎(chǔ)。

Figure7. A model of LAG3+ T cell and HRS cell interactions in classicHodgkin?lymphoma.

整個實驗結(jié)果驗證了一個經(jīng)典霍奇金淋巴瘤的免疫抑制微環(huán)境模型涯保。

MHC-II陰性HRS細(xì)胞(1型)分泌細(xì)胞因子诉濒，誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞中的LAG3。CD4+ LAG3+ T細(xì)胞包圍HRS細(xì)胞并分泌抑制細(xì)胞因子夕春。

MHC-II陽性細(xì)胞(2型)分泌一組獨(dú)特的細(xì)胞因子未荒，吸引FOXP3+和Th17細(xì)胞。

總之這些發(fā)現(xiàn)將有助于更深入地了解cHL免疫逃逸表型的機(jī)制及志，并有助于開發(fā)新的生物標(biāo)志物和治療策略片排。