最近要提取組織RNA奈揍，上網看了下其他前輩的經驗貼男翰，現(xiàn)將丁香園“丁香師兄”的經驗貼整理如下。原文鏈接https://www.biomart.cn/experiment/443/448/2282643.htm奏篙，有刪減
--自己的一些經驗--
之前都是在提細胞的RNA迫淹，用量一般是細胞瓶/6孔板的一個孔用1ml秘通，12/24孔板用0.5。
彩艷姐的意思是肺稀，這個用量是足夠多的，一般就按照這個量來加就可以了应民。后續(xù)異丙醇等按照trizol的用量來加。
操作過程中都是無酶的用具诲锹，冰上操作繁仁。
看完了丁香師兄的protocol和經驗，發(fā)現(xiàn)了自己之前忽略的幾個點：
①防止內源RNA酶的降解很重要归园，細胞要放在冰上，組織在液氮研磨成粉末并加 Trizol 之前不能化凍
②足量trizol可防止組織中內源性RNA酶降解RNA庸诱，充分研磨對于防止RNA降解也是類似的道理
③最后一步酒精洗滌可多加捻浦，充分反應，把RNA彈起來
關于配套試劑
Trizol 法提取 RNA 是要用到氯仿桥爽、異丙醇和乙醇的朱灿。氯仿遇光易分解，異丙醇雖然沒有特殊說明钠四，但我查的據(jù)說也是最好避光保存盗扒，不過這種試劑都是棕色瓶子形导，能遮蔽大部分的光線了环疼。
關于實驗時的防護：
RNA 很容易降解炫隶，所以實驗時一般都要求口罩帽子的，避免組織的污染煞檩。不過以我的經驗斟湃，好像內源性的 RNA 酶才是最主要的，也就是組織內本身的 RNA 酶凝赛。開始我是很小心墓猎，但是提取出來發(fā)現(xiàn)還是降解了，后來有經驗了赚楚，即使組織掉在地上毙沾，拿回去繼續(xù)提也沒問題（前提是不能化凍）。所以最最重要的是組織在液氮研磨成粉末并加 Trizol 之前不能化凍宠页，這也是 fast200 法提取效果不好的原因（fast200 法一般不用液氮研磨）左胞。
關于液氮研磨
萬事開頭難，液氮研磨是最開始的步驟举户，也是最辛苦的步驟烤宙。很多女孩子都怕液氮，畢竟是零下近 200 度的東西俭嘁，當然不是鬧著玩的门烂。不過只要小心操作，一般沒啥問題兄淫，我提了一個多月的 RNA，對液氮是很親切了蔓姚，呵呵捕虽。我是找了一個保溫杯，倒出一些液氮坡脐，然后再往研缽里倒泄私。研磨的時候多加幾次液氮，組織會慢慢變脆备闲，就會好研一些晌端，對于一些含水量比較大，很硬的組織恬砂，我是準備了刀片咧纠，切成小塊后再研磨，一定研磨充分泻骤，不要求研磨成奶粉狀漆羔，但至少得看不到明顯的顆粒梧奢，這樣 Trizol 才能充分和組織接觸，快速裂解組織演痒，也能防止組織的降解（Trizol 內含 RNA 酶抑制劑）亲轨。
關于組織量
研磨前最后稱一下組織的重量，畢竟 1 ml 的 Trizol 最多只能裂解 100 mg 的組織鸟顺。Trizol 里面是含有 RNA 酶抑制劑的惦蚊，如果組織過量，Trizol 無法完全浸潤組織無法完全裂解組織讯嫂，多余組織內的 RNA 酶等物質會導致 RNA 的降解蹦锋。這是 RNA 降解的很重要的原因。
關于提取步驟
標準 Trizol 提取步驟為 液氮研磨--加入 Trizol 裂解--加入氯仿抽提--離心--加入氯丙醇沉淀--離心--酒精洗滌--離心端姚。
因為提取的組織晕粪，在加入 Trizol 后增加了一步簡短的離心，可以幫助去掉一些無法降解的組織渐裸，比如纖維和雜質之類巫湘，然后取上清再加入氯仿，可以幫助提高氯仿的效率昏鹃。然后就是在加入 Trizol 后尚氛，可以將裂解液放到-80 凍存半小時以上，據(jù)說凍融過程中可以再次幫助更加充分的裂解細胞洞渤，分離蛋白和 RNA阅嘶。我試了一下，的確有效果载迄。
關于個步驟的時間
標準的時間是：
a. 液氮研磨（沒時間要求讯柔，只要組織不化就好, 我一般一個組織十分鐘左右，女孩子可能時間長一些护昧，畢竟體力活）
b. 加入 Trizol 裂解 5-10 分鐘（我覺得還是 10 分鐘比較好魂迄，有人說這步要放在冰上，但是我的經驗室溫就可以惋耙，室溫更有利于 Trizol 完全發(fā)揮作用捣炬，而且畢竟 Trizol 含有 RNA 酶抑制劑，不用擔心 RNA 降解）
c. 加入氯仿室溫靜置 15 分鐘（國產試劑真是坑爹啊绽榛，說明書把這步時間縮短到 3 分鐘湿酸，出來效果奇差）
d. 離心 15 分鐘，這是管見的一步灭美，離心后分成三層推溃，RNA 在上清里，所以離心管從離心機拿出來的時候要輕巧届腐，以免管內物質震蕩導致下層沉淀激起美莫。吸取上清的時候一定一定輕页眯，切忌吸取太多，少量即可厢呵，洗到 400-500ul 就 OK 了窝撵，再多就容易碰到下層沉淀了。
e. 加入異丙醇靜置 10 min襟铭，然后離心 10 min碌奉。
f. 用 75% 酒精洗滌沉淀，幫助分離剩余的有機試劑（剩余有機試劑過多會影響 OD 值和 PCR反應）寒砖，所以酒精盡量多加一些赐劣，一般說明書沒有說明這一步的時間，只是說劇烈渦旋震蕩哩都，我的經驗是一定把沉淀彈起來魁兼，讓浮在酒精中，然后放 1-2 min漠嵌，讓酒精充分接觸沉淀咐汞，充分溶解有機試劑，然后再離心儒鹿。
g. 加入 DEPC 處理水化撕，組織提取出來的量還是挺大的，雖然不是很純约炎，所以溶解液還是不能太少植阴，至少要 50ul，之前一個大姐給我說加 20ul 就可以圾浅，結果濃度直接高得光度計測不出來了掠手。而且濃度太高跑電泳時也跑不開，沒法鑒定狸捕。
