基本名詞
- 測序平臺：Hiseq2500,Hiseq X ten
- Flowcell：流動池症虑，用于吸附流動DNA片段的槽 道，包含8條泳道（lane）
- Lane：泳道祭示，可以使用Barcode在單Lane中檢測多樣本
- Barcode：區(qū)分樣本的標簽祝辣，是一級序列
- PE：pair-end，雙向測序缴阎，雙端測序，即一個片段简软，從正向和反向各讀一次蛮拔，2x150bp
- SE：single-end，單向測序痹升，單端測序建炫，只讀一次，1x150bp
- Read：一個讀長疼蛾，又叫讀段肛跌，是一段堿基序列，Reads是read的集合
- 測序深度：測序得到的堿基總量(bp) 與基因組大小的比值据过，它是評價測序量的標志之一
- 測序覆蓋度：基因組被測序得到的堿基覆蓋的比例
- 數(shù)據(jù)量：所測到的堿基總數(shù)惋砂，1kb=1000bp
- Fragment：一個DNA片段
學習內容
- 區(qū)分一二三代測序
- 二代測序大體流程
- NGS組學分類
- 測序原理
主要為Sanger法（第一代DNA測序技術）妒挎，即雙脫氧核苷酸法绳锅。
ddATP,ddTTP,ddGTP,ddCTP都是帶有放射性同位素標記的雙脫氧核苷酸，分別對應不同的堿基ATGC酝掩，由于其結構中比脫氧核苷酸多脫掉一個氧鳞芙，即不含羥基，無法在DNA合成過程中形成磷酸二酯鍵期虾，因此可中斷DNA鏈的繼續(xù)合成原朝。
在測序過程中，將待測樣品分為4份镶苞，每份改變一種脫氧核苷酸喳坠，如將dATP改為ddATP，這樣一來茂蚓，復制過程中將會在原來A的位置終止復制壕鹉，復制結束后，第一份樣品中素有片段皆是以ddATP為終端的不同長度的序列（可在不同位置終止復制）聋涨，接下來的三份樣品同理晾浴。最終就能得到長度不同，終端已知的DNA序列牍白。然后通過凝膠電泳和放射自顯影確定DNA序列脊凰。
- 一二三代測序大概介紹
- 第一代測序：通量低，準確度高茂腥，讀長1000bp左右狸涌，依然作為許多文獻測序金標準
第二代測序NGS：主要分為兩種測序平臺切省，Illumina測序（reads中等，通量較高帕胆，價格最低数尿，但測序質量較差）及454測序（reads較長，較準確惶楼，通量較低右蹦，成本偏高），Illumina是在Sanger法基礎上歼捐，邊測序變合成何陆，即用4中不同顏色熒光標記的dNTP，當NA聚合酶合成互補鏈時豹储，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光贷盲，根據(jù)捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息剥扣。
- 第三代測序（Single Molecule Real Tme DNA Sequencing）:單分子實時DNA測序技術巩剖，基于納米孔的單分子讀取計數(shù)，無需擴增可快速讀取序列钠怯。讀長非常高佳魔，測序速度快，準確度非常高晦炊，可直接檢測廣泛的堿基修飾鞠鲜。
- 第二代測序技術大體流程
- 建立DNA文庫：利用超聲波把DNA樣本打斷成200-500bp長的序列片段，同時在其兩端加上不同adapter(接頭)断国，構建出單鏈DNA文庫
- Flowcell：建立好文庫后贤姆，文庫DNA通過flowcell時會隨機附著在其表面的泳道上，且泳道表面有許多接頭稳衬，能與文庫DNA接頭相互配對霞捡，支持DNA在表面進行橋式PCR擴增
橋式PCR擴增與變形： 橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增薄疚，如圖4.a所示碧信。經過不斷的擴增和變性循環(huán)，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束输涕，每一個束都含有單個DNA模板的很多分拷貝音婶，進行這一過程的目的在于實現(xiàn)將堿基的信號強度放大，以達到測序所需的信號要求莱坎。
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測序：變合成邊測序衣式。
測序.png
