自從開始分享自己的CRISPR-Cas9學習筆記和記錄之后，收到了很多很有用的Tips以及一些未曾思考過的問題饺饭。分享學習筆記是一個非常好的學習方法砚哗，因每個人的背景知識、思維邏輯和思考角度都可能不一樣砰奕，因而在學習的側重點以及疑問點也會因此不同蛛芥。每當有人提出一個我未曾思考過的問題提鸟，就是我補充自己背景知識的機會，在來回交流過程中仅淑，經常得到許多意外收獲称勋。目前收到最多的問題是：
- 您好，我想要設計xx（非模式生物物種）的gRNA涯竟，你推薦的工具只能設計人和鼠的赡鲜，還有別的工具可以設計gRNA嗎？
- 您好庐船，我想知道怎么選擇一條合適的gRNA银酬。
這兩個問題可以說是直擊要害，非常關鍵筐钟。之前設計gRNA的時候是在張峰老師的網頁上隨手挑一個揩瞪，并根據網頁工具指示選擇gRNA，然而隨意確是最致命篓冲。今天我們要講的內容則是由基因編輯小伙伴蔣同學推薦的2020年CRISPR-Cas實驗設計和數(shù)據分析的最新綜述：Design and analysis of CRISPR–Cas experiments
文章主要分為以下兩部分：
- Software tools for guide design
- analysis of CRISPR editing experiments
由于內容性質和篇幅限制李破，我們今天只講第一部分。
1. 基因編輯器的譜系
說起CRISPR壹将，好像下意識的就接上Cas9嗤攻。然而Cas9（Streptococcus pyogenes ，SpCas9）并不是CIRSPR世界的唯一诽俯，但它是第一個被用于人類細胞基因編輯的Cas內切酶妇菱。既然我們學習基因編輯技術，即使用不上其他的工具暴区，也要了解它們世界大概都有誰恶耽。而這篇文章做了非常好的總結：
如圖可見：
（1）橫坐標代表年份，縱坐標則是這些基因編輯器在ClinVar數(shù)據庫中颜启，能編輯的致病相關的SNPs的分數(shù)偷俭。例如，在上半部分Cas核酸酶的部分缰盏，F(xiàn)nCas9出現(xiàn)的年份是2016年涌萤，它能夠靶向的致病相關SNPs比SpCas9要多。
（2）上半部分的Cas相關內容口猜，以張峰等人為主负溪。而下半部分的單堿編輯器主要以David Liu團隊為起始，他倆是好朋友济炎，他們和J. Keith Joung一起組成“CRISPR天團”川抡，并創(chuàng)立致力于單堿基編輯療法的公司Beam Therapeutics。我們都知道CRISPR最大的問題是脫靶，如果說CRISPR-Cas9是加農炮崖堤，那單堿基編輯器則是就是狙擊槍侍咱。對于單堿基突變引起的疾病，使用單堿基編輯技術糾正錯配的堿基密幔，是非常理想的治療手段楔脯。
（3）資源：ClinVar數(shù)據庫，ClinVar是NIH資助并有NCBI主導的共用數(shù)據庫胯甩，其收錄了人類基因變異和表型之間的關系昧廷。
既有這么多種基因編輯器，那gRNA的設計工具更是眼花繚亂偎箫，最近感覺CRISPR技術的更新木柬、進化速度遠遠大于我們學習的速度。
2. 常用的gRNA設計網站
一般來說淹办，會先打開張峰課題組的網站https://zlab.bio/guide-design-resources 眉枕，并在下方的“TOOLS FOR GUIDE DESIGN”隨意選擇一個gRNA設計工具（一般選用CRISPOR）。然而真的是隨便選一個就可以嗎娇唯？之前沒有思考和研究這些工具差異的原因是，由于研究的是人類基因寂玲，對于on-target以及off-target的預測方法已經趨于成熟塔插，因此個人主觀認為，不論是什么工具拓哟，大概都差不多吧想许。造成這種錯覺的原因是我對計算機科學、統(tǒng)計學的無知断序。試想一下流纹，on-target以及off-target的預測依賴于精妙的算法，而算法則依賴盡可能精準的模型违诗。不同的工具漱凝，很有可能使用不同的模型、算法以及判定標準诸迟。因此強烈推薦不要錯過這部分的解讀茸炒，本文是計算機科學家，從算法阵苇、統(tǒng)計學的角度解釋不同gRNA設計工具的差異壁公，這一點是我們濕實驗的人一直忽略或者是根本就沒想到的地方。
經統(tǒng)計绅项，目前至少有30中網頁gRNA設計工具紊册，還不包括一些需要自行下載代碼運行的設計工具。作者列舉了目前維護情況較好的幾個常用網頁工具進行介紹快耿，盈利性質的商業(yè)設計工具囊陡、需要自行運行代碼的工具以及有用途小眾的工具則不在此列芳绩。
縱觀這些工具可以很清晰的看到，不同的網站服務于不同的目的关斜，當一個網頁工具不能得到預期目的時示括，用戶需要混合搭配使用。以下是這些網頁工具的分點介紹：
2.1 input：信息輸入情況
在選擇好網頁工具之后痢畜，我們需要輸入一些關于目的基因或者序列的信息：
可上傳的數(shù)據類型：txt序列文檔垛膝，fastq序列文件，或者允許用戶輸入轉錄本ID丁稀，例如Ensemble ID 或者RefSeq吼拥。這對knockout來說非常方便，不然的話用用戶需要自行上傳外顯子或蛋白的CDS序列线衫。但這里需要注意轉錄本ID是有明確的序列凿可，而基因symbol則不是，其原因在于同一個基因可能會有N個轉錄本授账，因此需要特異性編輯某個轉錄本的實驗枯跑，網站工具允許選擇轉錄本ID是非常有用的，網頁工具的轉錄本序列源是Consensus CDS project (CCDS) 和APPRIS等權威源數(shù)據庫白热。
CHOPCHOP敛助、E-CRISP等一些工具會默認優(yōu)選選擇針對所有轉錄本的gRNA，而 CRISPick和GUIDES等工具可以定義更多參數(shù)屋确，例如纳击，gRNA的間隔、分布等等攻臀，因為可以設置gRNA分布焕数，因此可避免設計出來的高分gRNA集中在某個弱外顯子上，gRNA的分布自定義對設計library是非常有用的刨啸，通過提高gRNA的外顯子覆蓋度堡赔，從而保證基因編輯的效果。當目標基因的數(shù)目較少時设联，還可以手動依次設計加匈，而library的設計則無法將上萬的基因人工敲入，因此允許用戶批量定義目標基因的工具在library的設計中尤為便捷仑荐。
2.2 基因組和Cas酶多樣性雕拼、基因編輯目的
這部分可以很好的解答上面的第一個問題：
您好，我想要設計xx（非模式生物物種）的gRNA粘招，你推薦的工具只能設計人和鼠的啥寇，還有別的工具可以設計gRNA嗎？
通常這種情況，我的答案只能是抱歉辑甜，我不是很了解衰絮。
（1）基因組多樣性：根據上表可知，CHOPCHOP和CRISPOR可對hundreds的物種進行設計磷醋，而少數(shù)只有human and mouse這種模式生物召嘶。當這些工具都沒有包括實驗的目的物種時史简，需要找到支持用戶自行上傳參考基因組的工具子刮，例如：CRISPy-web (http://crispy.secondarymetabolites.org/) 毙沾。
（2）Cas酶多樣性：由于不同的Cas酶對應的PAM序列不同，因此期望所有工具都能涵蓋所有的Cas酶 gRNA序列設計不太實際骇陈。在這里CHOPCHOP就是最大的秀兒震庭，它可支持任何5′ or 3′ PAM，而CRISPOR你雌、RGEN Cas-Designer還能支持10中以上Cas酶器联。
（3）編輯目的： knockout、CRISPRa or CRISPRi婿崭？雖染CRISPR技術發(fā)展突飛猛進拨拓，但SpCas9仍然是目前使用最廣的Cas酶，而且Cas9相關的試劑是最全的（豐滿的現(xiàn)實）氓栈。目前來說渣磷，knockout還是最主流的應用，但有一些網頁工具還提供轉錄本起始位點颤绕，從而可以設計CRISPRa and i幸海。
2.3 可視化結果
看到就是實在祟身，有些用戶偏好可視化結果奥务，舉例CRISPOR。
粘貼序列后提交袜硫，可視化結果如下：
而GUIDES可提供依據GTEx數(shù)據庫的剪接體的可視化結果（想放圖來著氯葬，但是網頁結果太慢了），這一點用CHOPCHOP使用的UCSC基因組不同婉陷。
2.4 on-target和off-target的預測方法和能力
on-target：on-target的預測方法得益于基于SpCas9的CRISPR screens的發(fā)展帚称，目前有Rule Set 2、Moreno-Mateos score 秽澳、SAE score等方法闯睹。（1） 對于慢病毒傳遞系統(tǒng)以及RNA聚合酶III啟動子依賴的哺乳動物細胞，Rule Set 2是最好的方法担神；（2）而體外轉錄則Moreno-Mateos score表現(xiàn)更佳楼吃。因此需要依據自身實驗的特性選擇擁有更合適的on-target評價方法的gRNA設計工具。
off-target：目前有 CCTop、CFD score孩锡、Hsu-Zhang score和Elevation等可off-target活性酷宵，不僅僅是簡單計算錯配的數(shù)量。而不是所有的工具都使用了全面的脫靶預測方法躬窜，這將會導致存在“漏網之魚”浇垦，CRISPOR看起來是評價方式最多的方法。具體可參照上文中的table 1荣挨。
2.5 下游實驗設計也會影響gRNA的選擇
（1）對于構建單克隆細胞系的實驗來說男韧，可以在on-target的能力上讓步，從而避免脫靶的情況垦沉，而對于CRISPR library則在on-target上要求更高煌抒。
（2）對于使用U6啟動子的gRNA轉錄方式，使用帶有G為起始的gRNA可以增強U6啟動子轉錄能力厕倍。不過這方面我們在設計gRNA的oligo時寡壮，可以人為的加入G：
（3）此外，含有RNA聚合酶III終止序列(4 - 6個T)讹弯、與傳遞載體同源况既、或用于克隆的限制性酶切位點的gRNA，最好可以排除在外组民。著這里體現(xiàn)為Poly-T motif棒仍、Poly-N motif、hits in CpG islands臭胜、homology to delivery vector等多個評價選項莫其。具體仍可參照上表。
2.6 重點：基因注釋改變引起on-target的偏移
隨著人們對基因認知的不斷加深耸三，基因注釋不斷更新乱陡，原先認為是protein-coding的gene，可能會被重注釋為 長非編碼RNA（long noncoding RNAs仪壮，lncRNAs）憨颠，反之亦然，這種情況會造成targeting drift积锅。例如可在Addgene上購買到的CRISPR screens GeCKOv2爽彤，目前已經有少量偏移，而GeCKO的第一個版本缚陷，目前已經在Addgene上失去蹤跡适篙，大約是因為這個庫有“比較重大的缺陷”。
（小聲嘀咕箫爷，好似由于基因注釋引起的少量偏移對我們來說影響不大嚷节，畢竟只要篩到關鍵基因即可铆铆，不一定強求庫的完整性。而需要考慮的是丹喻，早期的libraries是在比較舊的on-target和off-target評價體系下設計的薄货，因此這些庫的on-target和脫靶情況需要重新評估。）
3. 使用不同工具設計同一個基因的gRNA
一個基因
作者使用3個網頁工具碍论，對人類 HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase1) 基因進行gRNA設計谅猾，結果如下：
（1）CHOPCHOP由于沒有ATG的排除標準，因此在起始位點ATG之前的gRNA也被囊括在內鳍悠。因此使用CHOPCHOP的時候税娜，要么自己粘貼某段特定的序列，不然就是在Snapgene中檢查gRNA的周邊情況藏研，以免在ATG之前敬矩。
（2）可見CRISPick正如前面所說，它設計的gRNA會有一定間隔的出現(xiàn)在基因的多個外顯子上蠢挡，并且覆蓋度可達protein coding序列的65%弧岳。而我們之前有說過gRNA越設計在后面，前面翻譯的蛋白就越完整业踏，很有可能前部分的蛋白就已經擁有生物學功能了禽炬，因此這里我們文章中提到的knockout的gRNA設計原則：gRNA要針對所有的isoform，并盡可能靠前勤家。這個原則并不是通用的腹尖，而是僅僅針對knockout，實際操作還需要各位自行考慮伐脖。
（3）GUIDES則主要依賴于基因注釋的結果热幔。
按照前面的介紹，我們不難發(fā)現(xiàn)讼庇，CRISPOR在多個方面都是比較優(yōu)秀的绎巨，但這里為什么沒有用CRISPOR的例子呢？
六個基因：一個基因不足以說明情況巫俺，則多試幾個认烁，根據下圖我們可以看到肿男，不同的網頁工具設計出來的gRNA有重疊部分介汹，究其原因則是因為使用了相似或者相同的on-target和off-target評價策略。例如：
（1）由于對基因isoform上的策略不同舶沛，CRISPick的168個gRNA被CHOPCHOP和E-CRISP排除在外嘹承，原因是當給定一個基因ID之后，CRISPick會自動選擇一個“最優(yōu)”轉錄本進行設計如庭，而CHOOCHOP傾向于針對所有轉錄本叹卷。
（2）三個網頁工具的重疊部分高達1169個gRNA撼港，因其有相似的on-target評價策略：Rule Set 2。但由于off-target策略差異骤竹，會導致有互相排除的部分帝牡。
（3）CHOPCHOP和E-CRISP有1082個重疊gRNA，因為他們都針對基因的5-65% coding序列蒙揣，而CHOPCHOP并不排除target在poly-T motif （RNA聚合酶III終止子）的gRNA靶溜，而CRISPick和E-CRISP則排除了，因此CHOPCHOP有一個較大的非重疊部分懒震。
這里要說一句老套的話罩息，具體問題具體分析，gRNA設計工具沒有孰優(yōu)孰劣个扰，在能拿到手的實驗資源條件下瓷炮，保證達到課題實驗目的和設計，綜合考慮設計gRNA递宅，是我們的最終目的娘香。該綜述非常值得一看，強推办龄。
