一鸽嫂、物理圖分類(lèi)及作圖方法
物理圖常用基本類(lèi)型是限制圖（restriction map）橡娄，熒光原位雜交圖圖（FISH）等。
物理圖的不同作圖方法可用于分析不同大小的基因組并達(dá)到不同的準(zhǔn)確性水平瓶籽。按照準(zhǔn)確度分為低分辨率和高分辨作圖。
1. 低分辨率作圖（Low resolution mapping）
（1）體細(xì)胞雜交/融合（somatic?cell hybridization/fusion; SCH）
? ? 體細(xì)胞雜交是將不同遺傳型的體細(xì)胞融合严拒，培養(yǎng)出新雜種個(gè)體的技術(shù)≈终海可在不同動(dòng)物之間竣蹦，植物之間长窄，甚至動(dòng)植物之間成功融合疮绷。植物之間的雜種細(xì)胞具有全能性，可以發(fā)育成完整的新個(gè)體只冻，動(dòng)物之間的雜種細(xì)胞一般只能停留在分裂傳代的水平，不能進(jìn)一步發(fā)育為完整個(gè)體舍悯。動(dòng)物之間的遠(yuǎn)緣和超遠(yuǎn)緣體細(xì)胞雜交對(duì)于人類(lèi)染色體的基因定位有很大價(jià)值。
原理
一般用人和小鼠細(xì)胞雜交(hybridoma cells)，雜交細(xì)胞中人和小鼠的基因可同時(shí)表達(dá)馁蒂，各自控制其蛋白質(zhì)合成，且兩者的染色體可以根據(jù)形態(tài)和染色顯帶特征加以鑒定和區(qū)分沮脖；表達(dá)的蛋白質(zhì)可以根據(jù)組分氨基酸數(shù)量，種類(lèi)免姿，排序不同加以區(qū)分故俐。
人鼠雜種細(xì)胞還有一個(gè)重要的特點(diǎn)是在其繁殖傳代過(guò)程中出現(xiàn)保留嚙齒類(lèi)一方染色體而人類(lèi)染色體則逐漸丟失，最后只剩一條或幾條，其原因至今不明筐乳。
綜合以上的特征路召，給人類(lèi)染色體基因定位研究創(chuàng)造了有利條件身隐，因?yàn)樵陔s種細(xì)胞內(nèi)人的染色體是逐代且隨機(jī)丟失的埠帕，人們可以獲得一系列含有人的各種不同染色體的雜種細(xì)胞系（cell line），是很好的實(shí)驗(yàn)材料锋勺。雜種細(xì)胞內(nèi)人鼠基因同時(shí)表達(dá)贪惹，一系列的雜種細(xì)胞里由于各自帶有人的不同染色體布近，基因存在不同显蝌，基因的表達(dá)也必然不同，于是可以根據(jù)這些基因不同的表達(dá)而把某些基因定位于某一特定的染色體上了瞒御。
??例如涌乳，一個(gè)缺乏β-半乳糖酶的小鼠突變細(xì)胞系宛乃，只要帶有人的第22號(hào)染色體吁朦，便可以重新合成這種酶，說(shuō)明這種酶的基因位于第2號(hào)染色體上擂仍。
?? ?當(dāng)然含有單個(gè)人類(lèi)染色體的雜種細(xì)胞系更有利于基因定位的研究乡括，但是技術(shù)原因使得體細(xì)胞雜交法不太可能剛剛好獲得24個(gè)各帶不同的單個(gè)人類(lèi)染色體的雜種細(xì)胞系铣鹏。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，通常是8-10個(gè)不同細(xì)胞系同時(shí)進(jìn)行，反復(fù)認(rèn)證棠赛，從而準(zhǔn)確定位依疼。
?具體操作及操作原理
實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖钱a(chǎn)生雜交的細(xì)胞误辑，那么培養(yǎng)基是關(guān)鍵，需要用具有細(xì)胞融合壓力和篩選壓力的培養(yǎng)基潦匈，即HAT培養(yǎng)基（H：次黃嘌呤吼旧，是HGPRT底物裕膀，DNA合成原料智绸；A：氨基蝶呤海铆，阻斷正常DNA合成殴边，嘌呤和TMP合成受到抑制板乙；T：胸苷，在胸苷激酶（TK酶）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸刺啦，為DNA合成提供原料苟蹈；hypoxanthine-aminopterin thymidine）。
DNA生物合成有兩條途徑搜变，De novo pathway和salvage pathway篡帕。其中De novo是主要途徑，但是aminopterin可以阻斷這個(gè)合成途徑茉唉；而salvage途徑需要在TK酶和HGPRT酶的作用下合成DNA献幔。
? ? 再來(lái)看看我們用的細(xì)胞，人的突變細(xì)胞株（缺乏HGPRT酶; TK+缚忧，HGPRT-）蒙具，小鼠突變細(xì)胞株（缺乏TK酶；TK-每强，HGPRT+）。所以在HAT培養(yǎng)基上奶栖，De novo途徑被抑制默蚌，只有成功融合的細(xì)胞才可以在HAT培養(yǎng)基上宣虾，利用H和T生長(zhǎng)，獲得系列雜交細(xì)胞株握玛。
（2）輻射雜交（radiation hybridization拂苹；RH）
? ? 與SCH相似，不同的是利用高劑量的X 射線(xiàn)將候選染色體（人類(lèi)染色體）打斷成若干片段，含有這種片段的細(xì)胞可與倉(cāng)鼠細(xì)胞形成雜交克隆。在這種雜交中翠语，人類(lèi)染色體片段被插入到倉(cāng)鼠染色體的中間部分，因此大部分克隆片段在進(jìn)行有絲分裂時(shí)處于穩(wěn)定的狀態(tài)。
2. 高分辨率作圖（High resolution mapping）
（1）熒光原位雜交作圖（Fluorescent in site hybridization；FISH）
將分子標(biāo)記與完整染色體雜交來(lái)確定標(biāo)記的位置。前兩個(gè)定位方式（SCH, RH）是基因的非直接定位媳危，而FISH更加直觀暮蹂。
? ? 熒光原位雜交是一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，使用的熒光探針僅與高度互補(bǔ)序列結(jié)合，熒光顯微鏡檢測(cè)和定位染色體上特定DNA序列。?
原理圖
綠色標(biāo)記為miR-133 microRNA荞估，紅色為myogenin mRNA，圖片顯示探測(cè)?差異化C2C12細(xì)胞中的兩種RNA的分布
靶序列在染色體上的定位
（2）限制性酶切位點(diǎn)作圖（Restriction site mapping）
? ? 在DNA分子上定位限制性酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置轴术。生成低分辨率圖譜后，可通過(guò)限制性核酸酶將片段切成較小的片段，以進(jìn)行進(jìn)一步分析，從而生成具有更高分辨率的圖譜悠栓。
圖中PFGE指的是脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)癞志，可以用于分子分型。
（3）克隆測(cè)序作圖（Sequencing by clones mapping）
? ? 使用克隆生成物理圖譜具有很高的分辨率。它使用基因組文庫(kù)中現(xiàn)有的克隆片段來(lái)形成重疊群导而。所使用的文庫(kù)將具有5至10倍的冗余度。但是，此類(lèi)技術(shù)產(chǎn)生的圖譜可能有未知缺口，或最終導(dǎo)致克隆飽和拾弃。
包括功能克隆（functional cloning）和圖位/定位克隆（positional cloning）搭盾。
藍(lán)色：功能克隆利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能蝌以，如蛋白質(zhì)缺陷的信息溶推，進(jìn)行基因定位（蛋白質(zhì)→mRNA→cDNA→探針→定位），進(jìn)而克隆該致病基因。然而略就，絕大多數(shù)遺傳病的基因產(chǎn)物不明，就無(wú)法用功能克隆策略進(jìn)行基因克隆
粉色：定位克隆與連鎖分析結(jié)合使用，利用基因定位作圖，通過(guò)分子標(biāo)記等找到來(lái)自該定位區(qū)的基因并進(jìn)行克隆，逐步明確這些基因的功能。即使知道很少或沒(méi)有關(guān)于該疾病的生化基礎(chǔ)的信息陶缺，此方法仍然有效苫费。
（4）序列標(biāo)記位點(diǎn)作圖（Sequence tagged site mapping泥畅；STS)?
?? 通過(guò)批量的基因組片段進(jìn)行PCR或雜交分析，來(lái)對(duì)短序列進(jìn)行定位作圖。STS概念由Olson等人在1989年提出闸拿。在評(píng)估PCR對(duì)人類(lèi)基因組研究的可能影響時(shí)台汇，他們提出已知圖譜位置的單拷貝DNA序列（STS）可作為沿染色體基因的遺傳和物理圖譜的標(biāo)記。與其他圖譜相比，STS的優(yōu)勢(shì)在于，可以構(gòu)建基因組STS數(shù)據(jù)庫(kù)，任何希望使用標(biāo)記的人都可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中查找STS序列嘀倒，合成特異性引物并在指定條件下進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)增（我的理解是碳胳，實(shí)驗(yàn)容易標(biāo)準(zhǔn)化产雹，不像是SCH等有一些隨機(jī)性）。
? ? STS是指一段200-500bp的已知DNA序列角溃，其在待分析的基因組或染色體上是唯一的（任何一個(gè)唯一的DNA序列都可以作為STS）咽扇。
? ? 一個(gè)DNA序列想要成為STS有兩個(gè)前提，一是序列必須是已知的，以便于利用PCR檢測(cè)STS在不同DNA片段中是否存在；二是STS必須在待研究的染色體上有唯一的定位，否則作圖數(shù)據(jù)模糊不清展姐。
STS序列中可能包含重復(fù)元素擂达，但是只要該位點(diǎn)兩端的序列是唯一且保守的镀钓，研究人員便可以使用PCR工具來(lái)鑒定基因組的這一部分探遵。因此棍掐，從廣義上講粟誓，STS包括微衛(wèi)星（SSR揽咕，STMS或SSRP），SCAR，CAP和ISSR等標(biāo)記（【現(xiàn)學(xué)現(xiàn)賣(mài)】-分子標(biāo)記Molecular marker）。
二控淡、物理圖主要應(yīng)用
基因組物理圖和基因組測(cè)序共同提供了有關(guān)核苷酸序列涧狮，順序，尤其是靶序列與性狀發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)。通過(guò)物理圖中分離和定位的單個(gè)DNA序列，它可以提供有關(guān)生物發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程的信息，從而鑒定該基因的特定功能和產(chǎn)生的相關(guān)性狀。物理圖提供的信息加上基因表達(dá)和調(diào)控的知識(shí)，可以開(kāi)發(fā)潛在的新療法來(lái)改變特定組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)模式。
此外，如果確定了疾病基因的位置和序列，可以參考有關(guān)基因功能和產(chǎn)物的知識(shí)，為攜帶該疾病基因的潛在患者提供醫(yī)療建議。
以上介紹的作圖法可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇。
