文獻標題：DoubletFinder: Doublet Detection in Single-Cell RNA Sequencing Data Using Artificial Nearest Neighbors
發(fā)表時間：April 03, 2019
發(fā)表雜志：Cell Systems（IF=8.673）
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cels.2019.03.003
摘要
單細胞RNA測序數(shù)據(jù)通常容易受doublets引入的技術(shù)誤差影響检号，這一現(xiàn)象限制了單細胞技術(shù)種的細胞通量，并且可能導(dǎo)致欺騙性的下游分析結(jié)果。作者開發(fā)了DoubletFinder沮尿，利用基因表達數(shù)據(jù)鑒定doublets叁丧。DoubletFinder通過隨機選取細胞對組成人造doublets咳蔚，根據(jù)每個真實細胞在基因表達空間中與人造doublets的接近程度來預(yù)測doublets端三。作者首先利用已知doublets信息的單細胞數(shù)據(jù)來展示DoubletFinder如何鑒定由轉(zhuǎn)錄特征不同的細胞形成的doublets耕挨，在移除這些doublets后细卧，差異表達分析得到了改善。其次筒占，作者提供了一種方法估計DoubletFinder的輸入?yún)?shù)贪庙，使其可以用于具有不同異質(zhì)性特點的scRNA-seq數(shù)據(jù)。最后翰苫，作者展示了DoubletFinder的”最佳實踐“止邮，并提示DoubletFinder對具有”雜交“（hybrid）轉(zhuǎn)錄特征的細胞類型不敏感这橙。
引言
在高通量單細胞RNA測序?qū)嶒炛校捎诩毎潜浑S機分配到液滴或納米孔中导披，根據(jù)Poisson統(tǒng)計分布屈扎，單個液滴包含超過一個細胞（doublets或multiplets）的頻率隨著上機細胞的濃度而改變。通常撩匕，如果上樣細胞濃度較高鹰晨，發(fā)生doublets的頻率也會增加。因此止毕，單細胞實驗中的doublets事件限制了實驗時的細胞通量模蜡。
目前有一些樣本復(fù)用（multiplexing）技術(shù)被開發(fā)出來，通常是利用不同樣本的barcode或遺傳學(xué)信息（如SNP）以區(qū)分來自不同樣本的細胞滓技，以及因上樣細胞過濃而形成的doublets哩牍。然而棚潦，它們無法區(qū)分來自相同樣本的doublets令漂。
DoubletFinder原理和流程
DoubletFinder流程可以分成兩個部分：
參數(shù)選擇
- 對原始表達矩陣做基本質(zhì)控（根據(jù)UMI數(shù)、線粒體基因比例等過濾低質(zhì)量細胞）丸边，并完成Seurat一般流程叠必；
- 隨機選擇細胞對，對原始UMI值取平均妹窖，合成人造doublets纬朝，并與原數(shù)據(jù)合并，使得合成doublets占所有細胞的比例為pN骄呼。默認最大pN為25%共苛，目的是生成足夠多的人工doublets；
- 按照原數(shù)據(jù)的參數(shù)蜓萄，對合并數(shù)據(jù)重新運行Seurat流程到主成分分析（PCA）這一步隅茎。需要注意的是，在合并數(shù)據(jù)中嫉沽，不對nUMI進行線性回歸削弱辟犀，目的是保留doublets和singlets的差異；
- 將合并數(shù)據(jù)的細胞在主成分空間的嵌入信息轉(zhuǎn)換成歐幾里得距離矩陣绸硕，基于該距離矩陣定義每個細胞的最近近鄰（nearest neighbors堂竟，NN）；
- 用pK表示領(lǐng)域大胁Ｅ濉（neighborhood size出嘹，例如對5,000細胞的數(shù)據(jù)，pK=0.01時咬崔，相當于尋找給定細胞近鄰的200個細胞）税稼。將人造NN（artificial nearest neighbors，ANN）數(shù)除以領(lǐng)域大小，得到人造NN的比例（pANN）娶聘；
- 對不同的pN-pK組合分別計算pANN闻镶。利用 BCmvn 最大化的方法選擇最優(yōu)pK，而將pN固定為25%丸升，并利用該組合下的pANN鑒別doublets铆农；
鑒定doublets
- 根據(jù)期望doublet rate，估計總doublets數(shù)的期望值狡耻；
- （可選）根據(jù)Poisson doublet形成率估計異型來源的（heterotypic）doublets期望值墩剖。這里涉及一個同型來源（homotypic）doublets的校正步驟，同型doublets的比例（pHomo）等于每個細胞類型頻率的平方和夷狰。將1-pHomo作為異型doublets的頻率pHeter岭皂，計算異型doublets的期望數(shù)量；
- 根據(jù)doublets的期望數(shù)設(shè)置pANN的閾值沼头，鑒定并去除doublets爷绘。
關(guān)于BCmvn
在數(shù)據(jù)分布中，BC（bimodality coefficient）用來衡量與單峰分布的偏離程度进倍。在DoubletFinder里土至，作者假設(shè)最優(yōu)的pK-pN組合應(yīng)該使得pANN呈非單峰分布，也就是說doublet（pANN偏大）和singlet（pANN偏谢ァ）能夠截然分成兩個峰陶因。對于每個pK-pN組合都可以根據(jù)pANN的分布計算BC值。對給定pK值下的所有pN（例如從5%到25%）垂蜗，計算BC值的均值 楷扬，以及方差
，二者相除得到 BCmvn 值贴见，選取最大值所代表的pK作為最優(yōu)pK烘苹。
結(jié)果
作者以Demuxlet和cell hashing的數(shù)據(jù)作為已知doublet信息（即Ground-truth）的參考，評估DoubletFinder的表現(xiàn)蝇刀。
首先作者評估了pN和pK對分類準確性的影響螟加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純改變pN參數(shù)幾乎不影響分類效果，因此默認設(shè)置為25%吞琐，為的是生成足夠多的人工doublets捆探。相反，pK過小或過大都會使分類準確性下降站粟。我的理解是黍图，如果doublets本身的表達譜差異較大，pK過小時奴烙，相當于只能找到和人工doublets相似度較高的doublets助被，假陰性率會增加剖张；而pK過大到一定程度時，每個細胞的pANN就被稀釋了揩环。因此pK需要根據(jù)不同數(shù)據(jù)集進行優(yōu)化（圖1C）搔弄。
作者接下來還測試了DoubletFinder和nUMI的分類效果，發(fā)現(xiàn)DoubletFinder顯著優(yōu)于nUMI丰滑，并且即使二者聯(lián)合后也幾乎和單獨使用DoubletFinder沒有差別（圖1D）顾犹。
Ground-truth數(shù)據(jù)包含樣本內(nèi)和樣本間doublets，而Demuxlet鑒定的是樣本間doublets褒墨，因此作者需要結(jié)合期望的doublet rate增加樣本內(nèi)doublets的估計數(shù)量炫刷。最后的結(jié)果顯示DoubletFinder在Demuxlet的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了某些來自樣本內(nèi)、不同細胞類型組成的doublets郁妈，但似乎對同型doublets的鑒定效果不佳（圖1E浑玛、F）。
最后噩咪，作者比較了doublet去除前后對差異表達分析的影響顾彰，意料之中地，去除doublet后各個細胞類型能鑒定出額外的差異基因剧腻。
作者同樣測試了細胞聚類數(shù)和聚類區(qū)分度對DoubletFinder的影響（圖2A拘央、B）。當數(shù)據(jù)中細胞類型較少時书在，pK對結(jié)果的影響不大，而隨著細胞類型的增多拆又，過大的pK反而降低分類的準確性儒旬，因此更加強調(diào)了參數(shù)優(yōu)化的重要性。而當數(shù)據(jù)的異質(zhì)性不大（例如pDE為0.5%）時帖族，無論pK如何改變栈源，其分類效果都不是很好，這也再次強調(diào)了DoubletFinder不適用于異質(zhì)性較低的數(shù)據(jù)集竖般，例如經(jīng)過分選純化的單一細胞類型樣本甚垦。
最后，作者使用真實數(shù)據(jù)測試了DoubletFinder對下游差異表達分析的改善情況涣雕。這套數(shù)據(jù)中包含一類經(jīng)過實驗驗證的新細胞類型（CDTC）艰亮，它同時表達CDIC和CDPC的marker基因，DoubletFinder準確地講64%的CDTC鑒定為singlets挣郭。在校正了同型doublets比例后迄埃，97%的CDTC都被鑒定為singlets。
討論
總的來說兑障，DoubletFinder適用于鑒定來自不同樣本或不同細胞類型的doublets侄非，因為這些doublets具有與singlets明顯不同的轉(zhuǎn)錄組特征蕉汪。對于同型doublets，DoubletFinder的表現(xiàn)較差逞怨。作者認為者疤，與Demuxlet或Cell Hashing聯(lián)合使用能幫助鑒定出來自不同樣本的同型doublets，一定程度上彌補DoubletFinder的缺陷叠赦。但我個人認為宛渐，用到這兩個技術(shù)的單細胞文獻確實也不多，作者的想法可能最多也就稍微解決一下上樣濃度過大的問題眯搭，通俗的說就是擠牙膏般地省一些科研經(jīng)費……
和Scrublet文章的觀點類似窥翩，同型doublets本身難以通過NN的方式對下游分析的影響一般比異型doublets小得多，為了防止doublet效應(yīng)的過度校正（假陽性率過高）鳞仙，兩種方法都傾向于保留這部分細胞寇蚊。DoubletFinder給出了估計同型doublets比例的選項，并提出預(yù)先對細胞類型做注釋可能有助于更準確地估計同型doublets棍好≌贪叮總之，感覺就是你需要在下游分析出問題的時候時不時回顧前期的質(zhì)控借笙。
