2020/5/26 今天介紹的文獻(xiàn)是美國(guó)哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院的學(xué)者于2019年7月在Cell上發(fā)表的喜每，名為Intra- and Inter-cellular Rewiring of the Human Colon during Ulcerative Colitis（人類結(jié)腸在潰瘍性結(jié)腸炎期間出現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間的重構(gòu)）的文獻(xiàn)瞬矩。研究者們分析了潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者結(jié)腸發(fā)炎區(qū)域件炉、非發(fā)炎區(qū)域以及健康人結(jié)腸組織的單細(xì)胞表達(dá)譜數(shù)據(jù)凉泄，分析了表達(dá)譜和細(xì)胞亞群比例的變化是如何促進(jìn)了炎癥的進(jìn)展，并且如何抵抗抗腫瘤壞死因子（anti-TNF）治療船逮。另外丹禀，研究組也分析了細(xì)胞間相互作用的改變與細(xì)胞亞群比例變化的關(guān)系。
1 研究背景
眾所周知周伦，組織是通過多種上皮夕春、免疫和基質(zhì)細(xì)胞的協(xié)同作用發(fā)揮功能，但是這種相互作用使我們很難確定疾病的因果機(jī)制专挪。一個(gè)典型的例子是潰瘍性結(jié)腸炎及志，其發(fā)病機(jī)制是環(huán)境因素作用于遺傳易感人群，引發(fā)了腸道微生態(tài)的破壞寨腔，進(jìn)而導(dǎo)致免疫失衡和腸道粘膜持續(xù)炎癥∷俪蓿現(xiàn)有的研究報(bào)道的疾病風(fēng)險(xiǎn)等位基因突顯了發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵途徑，然而迫卢，處于危險(xiǎn)位點(diǎn)的潛在基因尚未全部定位到粘膜中的作用細(xì)胞倚搬，而且細(xì)胞中的作用途徑仍是未知的。另外乾蛤，抗腫瘤壞死因子英夫利昔單抗是潰瘍性結(jié)腸炎的突破性療法每界，但是30％的患者無反應(yīng)，許多人出現(xiàn)了耐藥性家卖，這種治療抗性如何產(chǎn)生仍然是未解之謎眨层。
過去的RNA測(cè)序技術(shù)需要對(duì)整個(gè)組織的表達(dá)值進(jìn)行平均，因此難以測(cè)量每個(gè)細(xì)胞區(qū)室的作用上荡。如今趴樱，單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)可以區(qū)分細(xì)胞表達(dá)與細(xì)胞頻率的變化，來幫助我們酪捡，增進(jìn)對(duì)復(fù)雜疾病的了解叁征。那么，單細(xì)胞RNA測(cè)序能夠?yàn)闈冃越Y(jié)腸炎做些什么逛薇？本文作者提出了以下問題：
（1）借助scRNA-seq捺疼，炎癥發(fā)生時(shí)細(xì)胞亞群如何改變，哪些細(xì)胞亞群高表達(dá)了致病基因永罚？
（2）通過比較炎癥組織與非炎癥組織在單細(xì)胞表達(dá)譜上的異同帅涂。可以了解這些未發(fā)炎組織和發(fā)炎組織共享的轉(zhuǎn)錄改變有哪些尤蛮。然后媳友，我們關(guān)注炎癥組織特異性的改變，以確定是什么改變加重了病情产捞。
（3）30%的患者對(duì)抗腫瘤壞死因子治療無反應(yīng)醇锚，還有很多患者在治療中產(chǎn)生了抗藥性。那么，通過單細(xì)胞測(cè)序焊唬，哪些細(xì)胞亞群高表達(dá)了腫瘤壞死因子恋昼？還有，細(xì)胞亞群和細(xì)胞表達(dá)的變化赶促，是怎樣導(dǎo)致了抗藥性的產(chǎn)生液肌？
（4）通過scRNA-seq，可以探究炎癥過程中鸥滨，細(xì)胞間相互作用的重構(gòu)與細(xì)胞亞群比例的變化的關(guān)系嗦哆。
2 研究結(jié)果
（1）健康個(gè)體和UC患者結(jié)腸活檢的scRNA-Seq圖譜
首先婿滓，研究者從18名UC患者和12名健康人的結(jié)腸鏡檢查中獲取了活檢樣本老速，為探究健康狀態(tài)向慢性炎癥的轉(zhuǎn)變過程，同時(shí)減少患者個(gè)體特異性的變異凸主，他們收集了每名受試者的配對(duì)樣本橘券，對(duì)于UC患者，配對(duì)樣本是指在結(jié)腸鏡下評(píng)估為正常組織的非發(fā)炎樣本卿吐，和發(fā)炎樣本旁舰。這樣，得到了三類不同樣本：健康組織樣本嗡官、UC患者的非發(fā)炎樣本和發(fā)炎組織樣本鬓梅。然后，他們將組織樣本分別處理為上皮組織和固有層組織谨湘，分別單細(xì)胞RNA測(cè)序。
（2）單細(xì)胞測(cè)序和聚類結(jié)果展示了腸道粘膜的51個(gè)細(xì)胞亞群及其分子特征
根據(jù)得到的測(cè)序數(shù)據(jù)芥丧，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類分群紧阔。首先，根據(jù)已知的標(biāo)記基因的表達(dá)续担，將每個(gè)樣本中的所有細(xì)胞初步分為上皮擅耽、基質(zhì)和免疫細(xì)胞。然后物遇，在初步分成三類的基礎(chǔ)上乖仇，對(duì)每一個(gè)類，經(jīng)過可變基因選擇询兴、批次校正乃沙、PCA降維、KNN聚類诗舰，一共鑒定到51種細(xì)胞警儒，包括15種上皮細(xì)胞、13種基質(zhì)細(xì)胞和23種免疫細(xì)胞，t-SNE算法生成的二維嵌入可視化的結(jié)果如圖所示蜀铲。這里的每一個(gè)點(diǎn)代表了一個(gè)細(xì)胞边琉，相同顏色的點(diǎn)表示同屬一個(gè)細(xì)胞亞群。
然后记劝，研究者進(jìn)行了單細(xì)胞的差異基因表達(dá)分析变姨。該圖展示了每個(gè)亞群的top10的差異基因的熱圖，x軸代表了細(xì)胞亞群種類厌丑。y軸代表了差異基因種類定欧。熱圖中的顏色代表了基因的表達(dá)水平。從這張圖可以明顯的看出蹄衷，每個(gè)亞群的差異基因是比較特異的忧额，而這種特異性的基因理論上可以作為該細(xì)胞類型的Marker基因，用已知的Markers對(duì)每個(gè)細(xì)胞亞群進(jìn)行了標(biāo)注愧口。
根據(jù)聚類結(jié)果和差異基因表達(dá)分析睦番，介紹了兩種健康結(jié)腸中的新的結(jié)腸細(xì)胞亞群，表達(dá)BEST4的腸上皮細(xì)胞與其他上皮細(xì)胞不同耍属，具有pH感受和電解質(zhì)平衡相關(guān)基因的富集托嚣，包括耳蝶呤2和3（OTOP2/3）、檢測(cè)pH和感受酸味的質(zhì)子通道厚骗、催化碳酸氫鹽形成的碳酸酐酶VII（CA7）和輸出碳酸氫鹽的BEST4示启。多個(gè)成纖維細(xì)胞群有不同的WNT/BMP信號(hào)基因，可能反映了隱窩和絨毛的不同位置领舰。在隱窩附近的有WNT2B夫嗓，WNT4和DKK3的富集，而在絨毛附近的有BMP4冲秽、BMP5和WNT5A/B的富集舍咖。這些基因有許多是上皮下的telocyte，那是支撐上皮的一小群成纖維細(xì)胞锉桑。WNT2B+成纖維細(xì)胞通過R-spondin-3與LGR5互作排霉，支撐ISC niche。RSPO3+成纖維細(xì)胞表達(dá)其他WNT/BMP基因和幾種不同的趨化因子民轴。
（3）UC患者中細(xì)胞組成與健康人有顯著差異
與健康對(duì)照組相比，非炎癥或炎癥樣本中后裸，許多細(xì)胞亞群的比例均存在顯著差異瑰钮，例如CD8+IL-17+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞微驶、M樣細(xì)胞和炎癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞（IAFs）亞群在炎癥進(jìn)展過程中顯著擴(kuò)增飞涂。其中，M樣細(xì)胞中IBD風(fēng)險(xiǎn)基因的表達(dá)水平也非常的高（圖4黃色框圖，CCL20和CCL23）较店。IAFs高表達(dá)與結(jié)腸炎士八，纖維化和癌癥相關(guān)的基因（圖4紫色框圖，IL11梁呈，IL24和IL13RA2）婚度。另外，在B細(xì)胞譜系中官卡，存在著漿細(xì)胞比例下調(diào)和濾泡細(xì)胞上調(diào)的過程蝗茁。
（4）疾病過程中大多數(shù)表達(dá)變化是由非炎癥和炎癥組織共享的
為了確定與疾病相關(guān)的表達(dá)改變，研究者們根據(jù)Finaket?al 于2015年提出的算法寻咒，將在某種疾病狀態(tài)下的哮翘，每個(gè)基因在特定細(xì)胞亞群中的“表達(dá)”建模為反映細(xì)胞亞群、疾病狀態(tài)和細(xì)胞內(nèi)基因檢測(cè)數(shù)的總和毛秘。這種算法引出了一個(gè)稱為差異表達(dá)系數(shù)的概念饭寺。差異表達(dá)系數(shù)，是由Finak等人提供的MAST算法R包叫挟，將上述參數(shù)代入方程自動(dòng)計(jì)算出來的艰匙。表示在一個(gè)特定細(xì)胞亞群中，相對(duì)某種疾病狀態(tài)抹恳，在另一種狀態(tài)下的员凝，差異基因表達(dá)改變的程度，DE系數(shù)絕對(duì)值越大奋献，說明相對(duì)前一種狀態(tài)健霹，后一種狀態(tài)中該基因在該細(xì)胞亞群中的表達(dá)差異越大。DE系數(shù)為0瓶蚂，則表示這種基因在某種細(xì)胞亞群中糖埋，對(duì)于兩種疾病狀態(tài)，表達(dá)沒有區(qū)別扬跋。
右圖G，橫坐標(biāo)表示非發(fā)炎組織與健康組織的DE系數(shù)凌节，縱坐標(biāo)表示發(fā)炎組織與正常組織的DE系數(shù)钦听，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)特定的細(xì)胞亞群在某一基因中三種疾病狀態(tài)兩兩比較下的兩種DE系數(shù)，越接近圖中的回歸線位置倍奢，說明這部分細(xì)胞亞群在這些基因中的炎癥和非炎癥狀態(tài)下都沒有顯著區(qū)別朴上。可以看到卒煞，大部分點(diǎn)都位于回歸線附近痪宰。這說明，大多數(shù)表達(dá)改變，在非炎癥組織和炎癥組織中共享衣撬。這進(jìn)一步說明UC的轉(zhuǎn)錄特征在發(fā)炎之前就存在乖订，或在消退后持續(xù)存在【吡罚可能提示了一種臨床意義：對(duì)于UC患者活動(dòng)期發(fā)生后的臨床干預(yù)可能要持續(xù)到炎癥消退后的一段時(shí)間乍构，另外可以通過轉(zhuǎn)錄組分析，在結(jié)腸鏡下出現(xiàn)炎癥組織前扛点，就預(yù)測(cè)UC的發(fā)生哥遮。
圖A-F是炎癥和健康組織的差異基因表達(dá)分析的火山圖，ABC分別代表了上皮陵究，基質(zhì)和髓質(zhì)或適應(yīng)性區(qū)室中所有細(xì)胞亞群之間的綜合變化眠饮。DEF代表區(qū)室中特定細(xì)胞亞群的獨(dú)特變化。結(jié)果提示铜邮，上皮細(xì)胞的DE基因反映了通過激活固有免疫恢復(fù)自穩(wěn)仪召，比如上調(diào)抗微生物和抗氧化物防御通路，黏蛋白生物合成和 II類主要組織相容性復(fù)合物的機(jī)制牲距。在基底層中返咱，成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥、纖維化和組織修復(fù)相關(guān)的基因牍鞠，而內(nèi)皮細(xì)胞的變化支持組織的血管形成咖摹。免疫細(xì)胞中，髓樣細(xì)胞和T細(xì)胞激活共刺激和共抑制基因难述，B細(xì)胞高表達(dá)IgG類別轉(zhuǎn)換基因萤晴。
（5）潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸上皮細(xì)胞的代謝變化，T細(xì)胞亞群中誘導(dǎo)促炎性IL-17反應(yīng)和免疫檢查點(diǎn)
研究者對(duì)炎癥過程中的239個(gè)KEGG通路的變化作圖攀芯，揭示了腸上皮細(xì)胞的代謝變化屯断，包括從氧化磷酸化到糖酵解的轉(zhuǎn)變，精氨酸生物合成酶的誘導(dǎo)（例如侣诺，NOS2和ASS1）殖演，以及用于降解支鏈氨基酸的酶的下調(diào)，尤其是AUH（一種推定的風(fēng)險(xiǎn)基因）年鸳。腸上皮細(xì)胞還誘導(dǎo)了HIF1途徑趴久，這是單核細(xì)胞糖酵解轉(zhuǎn)變的一個(gè)原因。這些變化可能是由于腸道細(xì)菌短鏈脂肪酸生產(chǎn)受損所致搔确，因?yàn)樯掀ぜ?xì)胞下調(diào)了β-氧化途徑以及丁酸和丙酸的代謝途徑彼棍，但上調(diào)了膳食脂肪酸的途徑（例如灭忠，α-亞油酸）。
可以看到座硕，UC期間弛作，紅色框圖指示的幾個(gè)CD4 +亞群上調(diào)了IL17A，可能反映了IL17A表達(dá)的每細(xì)胞增長(zhǎng)坎吻。藍(lán)色框圖指示了缆蝉，在兩種疾病狀態(tài)下CD8 +亞群對(duì)IL17A的誘導(dǎo)最強(qiáng)。黃色框圖指示了瘦真，T細(xì)胞的大多數(shù)亞群誘導(dǎo)了共刺激和共抑制程序刊头，與抑制慢性免疫激活的嘗試一致 。?
（6）IAF和單核細(xì)胞通過OSM通路抵抗TNF抗體藥物
我們知道诸尽，單克隆抗TNF抗體是IBD的突破性療法原杂，但是30％的IBD患者無反應(yīng)，并且許多人獲得了耐藥性您机。是哪些細(xì)胞亞群在炎癥發(fā)生中高表達(dá)了腫瘤壞死因子穿肄？還有，細(xì)胞亞群和細(xì)胞表達(dá)的變化际看，是怎樣導(dǎo)致了抗藥性的產(chǎn)生咸产？圖9A分析了健康，未發(fā)炎和發(fā)炎的樣中每個(gè)細(xì)胞亞群表達(dá)的總TNF轉(zhuǎn)錄本的分?jǐn)?shù)仲闽。結(jié)果表明脑溢，腫瘤壞死因子的表達(dá)在UC期間發(fā)生了變化，Treg細(xì)胞成為TNF表達(dá)的關(guān)鍵角色赖欣。單分子熒光原位雜交和免疫熒光測(cè)定結(jié)果也驗(yàn)證了FOXP3+IL10?+TNF?+細(xì)胞的擴(kuò)增屑彻。
IAF中表達(dá)最活躍的基因之一是推定的風(fēng)險(xiǎn)基因OSMR社牲，以及預(yù)測(cè)抗TNF反應(yīng)的細(xì)胞因子抑瘤素 M（OSM）的受體。OSM和OSMR過去被認(rèn)為分別由未知的髓樣和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)悴了。OSM最富于炎性單核細(xì)胞和DC2搏恤，而OSMR最富于IAF。伴隨著炎癥過程中這些亞群的擴(kuò)增湃交，上述發(fā)現(xiàn)使我們假設(shè)結(jié)腸的細(xì)胞重塑可能部分解釋了OSM與耐藥性之間的關(guān)系熟空。
研究者們采用Wang等人于2016年提出的一種對(duì)耐藥性和敏感性的基因信號(hào)的評(píng)分機(jī)制巡揍，對(duì)各個(gè)細(xì)胞亞群的抗TNF的耐藥性和敏感性的基因信號(hào)進(jìn)行了評(píng)分痛阻。結(jié)果表明菌瘪，藥物抗性信號(hào)在IAF腮敌、炎性單核細(xì)胞和DC2細(xì)胞中大量富集阱当。與耐藥性最相關(guān)的三個(gè)基因IL13RA2，TNFRSF11B和IL11是?IAF的marker糜工，在其他細(xì)胞中很少表達(dá)弊添。
研究者們又設(shè)計(jì)了一項(xiàng)逆向分析，測(cè)定并分析了20個(gè)抗腫瘤壞死因子治療反應(yīng)者捌木，27個(gè)無反應(yīng)者和健康對(duì)照組的治療前的上皮油坝、炎癥相關(guān)單核細(xì)胞和IAF的bulk抗藥性信號(hào)表達(dá)數(shù)據(jù)水平。證實(shí)了IAFs豐富的患者會(huì)對(duì)抗TNF治療產(chǎn)生抵抗刨裆。因此澈圈，IAF可能與West等報(bào)道的OSM介導(dǎo)的抗性有關(guān)。潛在的耐藥機(jī)制是OSM與TNF協(xié)同作用或表型復(fù)制帆啃，OSM的表型是TNF瞬女，激活了IAF中的下游靶標(biāo)。IAF和炎性單核細(xì)胞可能會(huì)在TNF阻滯期間補(bǔ)償努潘，從而導(dǎo)致耐藥性诽偷。
（7）細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的重構(gòu)解釋了疾病期間細(xì)胞比例的變化
接下來我們進(jìn)一步探究炎癥發(fā)生時(shí)細(xì)胞亞群間相互作用的變化疯坤。如圖ABC报慕，我們將受體-配體對(duì)映射到細(xì)胞亞群上，以構(gòu)建細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)压怠。每個(gè)節(jié)點(diǎn)指一種細(xì)胞亞群眠冈，顏色代表譜系關(guān)系，面積代表細(xì)胞比例刑峡。淺灰色和深灰色的線分別連接了疾病期間洋闽，相對(duì)健康狀態(tài)下的同源受體—配體對(duì)表達(dá)顯著增加 (p < 0.05)和差異表達(dá)(p < 0.05)的細(xì)胞亞群。
可以看到突梦，健康狀態(tài)的相互作用網(wǎng)絡(luò)描繪了不同的細(xì)胞區(qū)室诫舅。而隨著疾病的進(jìn)展，譜系間的串?dāng)_不斷增強(qiáng)宫患，區(qū)室化不斷減少刊懈。與健康組織相比，炎癥組織顯示B細(xì)胞與T細(xì)胞娃闲，巨噬細(xì)胞和CD8?+?IL-17+?T細(xì)胞之間的相互作用發(fā)生重構(gòu)虚汛。右圖D顯示了各細(xì)胞亞群在健康，非發(fā)炎和發(fā)炎網(wǎng)絡(luò)中的平均網(wǎng)絡(luò)居中性皇帮，Y軸表示亞群種類卷哩，x軸表示平均居中量值。圖中顯示了排名最高的10個(gè)細(xì)胞亞群的平均值属拾〗辏可以看出冷溶，M樣細(xì)胞，IAFs和炎性單核細(xì)胞是細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)中最核心的節(jié)點(diǎn)尊浓，表明其在潰瘍性結(jié)腸炎的細(xì)胞間相互作用中起到了介導(dǎo)其他亞群的作用逞频。
那么，是什么導(dǎo)致了細(xì)胞亞群比例的變化呢栋齿？研究者們假設(shè)這種比例的變化可以用細(xì)胞-細(xì)胞相互作用基因的變化來解釋苗胀。為了驗(yàn)證假設(shè)，我們檢索了所有細(xì)胞亞群對(duì)瓦堵，對(duì)于每個(gè)受體-配體對(duì)基协，檢查樣品中一個(gè)細(xì)胞亞群中配體的表達(dá)水平是否與樣品中表達(dá)其受體的細(xì)胞亞群的比例相關(guān)。每個(gè)小圖顯示菇用，對(duì)于通過受體-配體相互作用連接的一對(duì)細(xì)胞堡掏，x軸所代表的配體在一個(gè)細(xì)胞亞群中的平均表達(dá)水平和y軸所代表的表達(dá)受體的細(xì)胞亞群的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化比例中的每個(gè)樣本，顏色標(biāo)記了每個(gè)樣本的疾病狀態(tài)刨疼，可以看到配體的表達(dá)水平和受體的細(xì)胞亞群的比例呈正相關(guān)關(guān)系泉唁。證明了細(xì)胞亞群比例的變化可以用其他細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用基因的變化來解釋。
3. 研究總結(jié)
（1）從腸粘膜中鑒定出51種細(xì)胞亞群揩慕，主要是上皮亭畜、基質(zhì)和免疫細(xì)胞；
（2）M樣細(xì)胞迎卤、炎性單核細(xì)胞拴鸵、炎性成纖維細(xì)胞（IAF）、CD8+IL-17+T細(xì)胞蜗搔，在UC中增多劲藐，表明其在炎癥產(chǎn)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用；
（3）炎性單核細(xì)胞和IAF可能分別通過表達(dá)抑瘤素M（OSM）及其受體樟凄，介導(dǎo)抗TNF治療的耐藥性聘芜；
（4）細(xì)胞間相互作用的重構(gòu)解釋了細(xì)胞亞群比例的變化；
（5）M樣細(xì)胞缝龄、炎癥相關(guān)性成纖維細(xì)胞和炎癥相關(guān)性單核細(xì)胞是疾病期間細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵位點(diǎn)汰现。
