An independent poor-prognosis subtype of breast cancer defined by a distinct tumor immune microenvironment

一種由獨(dú)特的腫瘤免疫微環(huán)境定義的獨(dú)立貧血亞型乳腺癌

發(fā)表期刊：Nat Commun

發(fā)表日期：2019 Dec 3

影響因子：12.121

DOI:??10.1038/s41467-019-13329-5

一弥鹦、研究背景

腫瘤微環(huán)境影響癌癥的起始和進(jìn)展决瞳。在乳腺癌中超燃，臨床病理特征固逗，如年齡浅蚪，等級(jí)，階段和分子亞型與預(yù)后有關(guān)烫罩，并驅(qū)動(dòng)治療決策惜傲。5種臨床相關(guān)的分子亞型：Luminal A、Luminal B贝攒、Her2富集型盗誊、基底樣型和正常樣型，其發(fā)病率隘弊、生存率哈踱、預(yù)后和腫瘤生物學(xué)特性各不相同。

除了癌細(xì)胞生物學(xué)因素外长捧，炎癥微環(huán)境也影響著腫瘤的起始和進(jìn)展嚣鄙。癌細(xì)胞周圍的免疫微環(huán)境可以識(shí)別和抑制腫瘤生長(zhǎng)或促進(jìn)進(jìn)展。在乳腺癌中串结，高免疫浸潤已與更好的臨床結(jié)果哑子。此外，高免疫浸潤已與新輔助和輔助化療的反應(yīng)增加相關(guān)肌割。

二卧蜓、材料與方法

?1?數(shù)據(jù)來源

1）基因表達(dá)：手術(shù)收集的MicMa隊(duì)列（其中的子集用于分析， MicMa-nCounter（n = 96把敞，F(xiàn)FPE）弥奸，MicMa-Agilent（n=104，新鮮冷凍組織））

2）RNA-seq：OSLO2-EMIT0隊(duì)列（GSE135298奋早，原始數(shù)據(jù)在EGAS00001003631）

3）公開的數(shù)據(jù)：表達(dá)數(shù)據(jù)從GEO盛霎、European Genome-phenome Archive赠橙、ArrayExpress或TCGA獲得；METABRIC隊(duì)列

?2?分析流程

1）基因集富集分析

2）無監(jiān)督聚類獲得免疫簇：基于509個(gè)基因愤炸，使用R包pheatmap對(duì)患者的相關(guān)性矩陣進(jìn)行層次聚類

3）Nanodissect：用于淋巴和髓細(xì)胞浸潤的預(yù)測(cè)期揪，淋巴細(xì)胞或骨髓細(xì)胞浸潤的nanodissect分?jǐn)?shù)反映了樣本中各自基因的平均表達(dá)量

4）CIBERSORT（22種類型的浸潤性免疫細(xì)胞的絕對(duì)比例）、ssGSEA（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化规个、干細(xì)胞凤薛、增殖和細(xì)胞周期相關(guān)途徑的基因集）

5）二項(xiàng)式邏輯回歸預(yù)測(cè)免疫集群：R包glmnet （構(gòu)建模型公式）

6）免疫浸潤的病理評(píng)估

7）ROR評(píng)分：ROR-Score=0.05×Basal+0.12×Her2-enriched???0.34×Luminal A+0.23×Luminal B；其中诞仓，基底缤苫、Her2富集、管腔A和管腔B是每個(gè)樣本與R中使用genefu軟件包獲得的質(zhì)心的相關(guān)性

8）統(tǒng)計(jì)學(xué)墅拭、生存分析活玲、多變量Cox回歸分析

三、結(jié)果展示

01 -?乳腺癌的免疫簇并反映了逐漸的免疫浸潤

測(cè)量了MicMa隊(duì)列的95個(gè)腫瘤樣本中760個(gè)基因的表達(dá)帜矾，該陣列旨在剖析實(shí)體腫瘤中的免疫浸潤翼虫。這95個(gè)樣本中的79個(gè)樣本之前已經(jīng)通過Agilent全基因組4×44K寡核陣列進(jìn)行了剖析屑柔。首先使用Pearson和Spearman相關(guān)性比較了兩個(gè)平臺(tái)獲得的表達(dá)屡萤，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)值之間存在高度的正相關(guān)（補(bǔ)充圖1A）。

為了根據(jù)免疫相關(guān)基因表達(dá)的相似性對(duì)患者進(jìn)行分組掸宛，對(duì)相關(guān)矩陣進(jìn)行了無監(jiān)督的分層聚類（圖1a和補(bǔ)充圖1B）死陆。從3到10個(gè)聚類的輪廓圖分析表明，3個(gè)聚類最好地捕獲了nCounter和Agilent數(shù)據(jù)集的分割（補(bǔ)充圖1C唧瘾，D）措译。比較了兩個(gè)數(shù)據(jù)集MicMa-nCounter和MicMa-Agilent的聚類結(jié)果。在這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中饰序，有79個(gè)樣本是重疊的领虹。隨著用于測(cè)量基因表達(dá)的不同平臺(tái)，以及基因列表和用于執(zhí)行無監(jiān)督聚類的樣本的不完全重疊求豫，仍然發(fā)現(xiàn)79個(gè)重疊樣本的聚類分配顯著相似塌衰。

為了確認(rèn)集群與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)（圖1b），使用算法Nanodissect為總淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞浸潤打分蝠嘉。Nanodissect評(píng)分首先在MicMa隊(duì)列中使用有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家分析的匹配蘇木精和曙紅切片的免疫浸潤評(píng)估進(jìn)行驗(yàn)證（圖1c和補(bǔ)充圖1E）最疆。發(fā)現(xiàn)這三個(gè)簇與Nanodissect淋巴細(xì)胞（圖1b）和骨髓細(xì)胞（補(bǔ)充圖1F）評(píng)分顯著相關(guān)。得出結(jié)論蚤告，簇A-C反映了逐漸的免疫浸潤努酸，因此被稱為免疫簇。

圖1 免疫簇與總免疫浸潤有關(guān)

補(bǔ)充圖1 MicMa隊(duì)列中的免疫簇

使用其他9個(gè)隊(duì)列的表達(dá)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這些簇與淋巴/髓細(xì)胞浸潤之間的關(guān)聯(lián)杜恰。有509個(gè)基因在所有研究的數(shù)據(jù)集中被發(fā)現(xiàn)获诈，被用于無監(jiān)督聚類（圖1d和補(bǔ)充圖2A仍源，分別用于METABRIC和TCGA隊(duì)列的聚類）。在每個(gè)隊(duì)列中舔涎，所得到的三個(gè)聚類與淋巴和骨髓Nanodissect評(píng)分顯著相關(guān)（圖1e镜会；補(bǔ)充圖2B）。淋巴和髓細(xì)胞浸潤從簇A（藍(lán)色终抽；低浸潤戳表；冷腫瘤）逐漸增加到簇B（淺藍(lán)色；中等浸潤）和簇C（粉紅色昼伴；高浸潤匾旭；熱腫瘤）。

對(duì)于額外的一層驗(yàn)證圃郊，使用METABRIC隊(duì)列中免疫浸潤的病理評(píng)估价涝，這與Nanodissect評(píng)分（圖1f和補(bǔ)充圖2C）和免疫簇顯著相關(guān)。使用PanCancer免疫剖析陣列的基因進(jìn)行無監(jiān)督分層聚類持舆，可以根據(jù)免疫浸潤的漸進(jìn)水平對(duì)乳腺癌腫瘤進(jìn)行分組色瘩。

補(bǔ)充圖2 TCGA隊(duì)列中的免疫簇

02 -?免疫簇與預(yù)后相關(guān)

對(duì)于兩個(gè)最大的隊(duì)列METABRIC(n = 1904)和TCGA(n = 981)，發(fā)現(xiàn)簇B(具有中等水平的免疫浸潤)與更差的預(yù)后相關(guān)(補(bǔ)充圖3A逸寓，B)居兆。當(dāng)分別對(duì)ER陰性（補(bǔ)充圖3C，D）和ER陽性（補(bǔ)充圖3E竹伸，F(xiàn)）的病例進(jìn)行分層時(shí)泥栖，也觀察到簇B病例的這種更差的結(jié)果。為了完善觀察結(jié)果勋篓，根據(jù)簇B（淺藍(lán)色）與簇A和簇C（紫色）繪制了患者生存期圖吧享，并證實(shí)簇B患者的預(yù)后明顯且顯著惡化（圖2）。用相關(guān)生存數(shù)據(jù)在另外四個(gè)隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果譬嚣。結(jié)論是免疫簇與ER陰性和ER陽性乳腺癌的預(yù)后相關(guān)钢颂。

補(bǔ)充圖3 免疫簇與預(yù)后有關(guān)

圖2 免疫簇與預(yù)后有關(guān)

03 - 用二項(xiàng)式邏輯回歸預(yù)測(cè)免疫簇

基于免疫聚類的臨床相關(guān)性，旨在開發(fā)一種通用的方法拜银，能夠準(zhǔn)確而敏感地預(yù)測(cè)患者的預(yù)后較差的分類殊鞭，而不必依賴于無監(jiān)督聚類。作者使用二項(xiàng)式邏輯回歸盐股，通過lasso進(jìn)行懲罰钱豁，得到一組基因，這些基因可以敏感和特異地預(yù)測(cè)一個(gè)樣本是否屬于簇B疯汁，通過接收者操作特征曲線和曲線下面積（AUC）分析評(píng)估（圖3a）牲尺。96.3%的樣本被模型預(yù)測(cè)為簇A和簇C，而68.8%的樣本分到了簇B（圖3b）。

通過比較生存期對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)p值谤碳，發(fā)現(xiàn)lasso分類普遍改善了免疫簇與生存期之間的顯著關(guān)聯(lián)溃卡。lasso模型在另外5個(gè)隊(duì)列中得到了驗(yàn)證。圖3c-e為STAM(n = 856)蜒简、MAINZ(n= 200)和UPSA(n = 289)瘸羡，補(bǔ)充圖5A、B為CAL(n = 118)和PNC(n= 92)搓茬。

圖3 利用二項(xiàng)式邏輯回歸對(duì)簇B進(jìn)行預(yù)測(cè)犹赖。

由于二項(xiàng)式邏輯回歸只預(yù)測(cè)了兩個(gè)簇（簇B與簇A和簇C），進(jìn)行了另一輪二項(xiàng)式邏輯回歸卷仑，以高準(zhǔn)確度區(qū)分簇A和簇C（補(bǔ)充圖5C峻村，D）。

補(bǔ)充圖5 利用二項(xiàng)式邏輯回歸對(duì)聚類A和C進(jìn)行預(yù)測(cè)

04 -?免疫簇锡凝，一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素

作者進(jìn)一步研究了免疫簇與乳腺癌中著名的臨床病理特征（大小粘昨、年齡、等級(jí)窜锯、階段张肾、淋巴結(jié)受累和分子亞型（PAM50））的關(guān)系。簇A（免疫浸潤度低）富含ER陽性和Luminal病例锚扎，而簇C（免疫浸潤度高）中ER陰性和Basal樣病例比例較高吞瞪，ER陰性和ER陽性樣本以及PAM50亞型在預(yù)后不良的簇B中同樣占有一定比例（圖4a，b）工秩。

圖4 免疫群和臨床病理特征

使用多變量Cox回歸分析測(cè)試了免疫簇的預(yù)后影響尸饺，同時(shí)考慮了其他預(yù)后因素。發(fā)現(xiàn)免疫簇是模型生存的重要因素助币，如每個(gè)隊(duì)列Cox模型中與免疫群相關(guān)的顯著p值所示。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)免疫簇作為重要的預(yù)后生物標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)螟碎，采用了逐步回溯選擇的方法眉菱。對(duì)于所有隊(duì)列，免疫簇被保留在最佳擬合的最小模型中掉分，在11個(gè)隊(duì)列中的9個(gè)隊(duì)列中俭缓，免疫簇是一個(gè)顯著的預(yù)后變量。

05 -?具有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（ROR）評(píng)分的新RNA-seq數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證

EMIT0酥郭，這是OSLO2隊(duì)列研究的一個(gè)子集华坦，OSLO2-EMIT0由食品和藥物管理局批準(zhǔn)的Prosigna復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（ROR）分?jǐn)?shù)評(píng)估，ROR評(píng)分在標(biāo)準(zhǔn)的臨床病理特征之上增加了重要的預(yù)后信息不从。發(fā)現(xiàn)簇B組成的樣本與簇A和C相比具有中間的ROR評(píng)分（圖4c）惜姐，表明與簇B相關(guān)的不良預(yù)后不可能由ROR評(píng)分中包含的信息來解釋。當(dāng)分別評(píng)估ER陰性（補(bǔ)充圖7A）和ER陽性（補(bǔ)充圖7B）病例時(shí)有同樣結(jié)果。對(duì)于所有隊(duì)列通過已有方法計(jì)算ROR評(píng)分歹袁，該方法與PAM50亞型有關(guān)坷衍，并證實(shí)簇B由中間ROR評(píng)分組成（圖4d和補(bǔ)充圖7C，D）条舔。

補(bǔ)充圖7 根據(jù)免疫群和ER狀態(tài)進(jìn)行ROR評(píng)分

多變量回歸分析證實(shí)枫耳，免疫簇為ROR評(píng)分帶來了額外的預(yù)后價(jià)值，這體現(xiàn)在用ROR評(píng)分和免疫簇建立生存模型時(shí)孟抗，免疫簇的p值顯著迁杨。通過計(jì)算凈重分類改善（NRI）和綜合判別改善（IDI）指數(shù)，強(qiáng)調(diào)了免疫簇與ROR評(píng)分一起使用時(shí)凄硼，根據(jù)生存率對(duì)患者進(jìn)行分類的額外價(jià)值仑最，正如所有隊(duì)列中NRI和IDI系數(shù)為正值所示。NRI和IDI的置信區(qū)間（CI）構(gòu)建的Bootstrapping顯示帆喇，對(duì)于幾個(gè)隊(duì)列警医，免疫簇與ROR評(píng)分相加時(shí)，顯著改善了患者根據(jù)預(yù)后的分類坯钦。

06 - 免疫簇和對(duì)新輔助化療的反應(yīng)

進(jìn)一步評(píng)估了免疫簇與新輔助化療反應(yīng)之間的關(guān)系预皇，使用了來自8項(xiàng)研究（1377個(gè)樣本）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并使用lasso將每個(gè)樣本分配給其所屬的免疫簇婉刀。如圖4e吟温，發(fā)現(xiàn)簇C應(yīng)答者百分比最高，其次是簇A突颊，簇B應(yīng)答者百分比最低鲁豪。還計(jì)算了每個(gè)組中應(yīng)答者的百分比：簇C平均有42%的應(yīng)答者和58%的殘余疾病患者，而簇B有18%/82%的應(yīng)答者和13%/87%的殘余疾病患者律秃。由于pCR率作為ER狀態(tài)的函數(shù)不同爬橡，還獨(dú)立計(jì)算了ER陽性和ER陰性病例的應(yīng)答者比例，發(fā)現(xiàn)無論ER狀態(tài)如何棒动，簇B的應(yīng)答者比例最低（分別為補(bǔ)充圖8A糙申、B）。

補(bǔ)充圖8 ER狀態(tài)下的免疫簇和對(duì)新輔助化療的反應(yīng)

對(duì)于每個(gè)對(duì)新輔助化療有反應(yīng)的隊(duì)列船惨，評(píng)估了pCR和非pCR病例在各免疫群中的分布柜裸。當(dāng)考慮整個(gè)隊(duì)列時(shí)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者在各免疫群組的分布有顯著不同粱锐，簇B的應(yīng)答者較少疙挺，簇C組的應(yīng)答者居多；當(dāng)按ER狀態(tài)拆分時(shí)怜浅，雖然并非總是顯著铐然，但也觀察到同樣的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，簇C中的患者有更高的概率成為應(yīng)答者锦爵。研究結(jié)果還突出了簇B的低響應(yīng)率舱殿，表明這類患者可能是新的新輔助治療方案測(cè)試的候選人。

07 - 免疫簇的計(jì)算機(jī)剖析

為了評(píng)估集群中的逐漸免疫浸潤是否可以解釋與預(yù)后的關(guān)聯(lián)险掀，在Cox多變量回歸分析中測(cè)試了免疫集群或總免疫浸潤評(píng)分中哪一個(gè)對(duì)生存更有預(yù)測(cè)性沪袭。作者假設(shè)特定的免疫細(xì)胞類型混合物，而不是腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞總數(shù)樟氢，可能是簇B預(yù)后差的原因冈绊。

使用CIBERSORT算法估計(jì)22種不同的免疫細(xì)胞類型的比例，對(duì)這種細(xì)胞類型特異性中位數(shù)浸潤分?jǐn)?shù)進(jìn)行無監(jiān)督聚類（圖5a）埠啃。簇C病例中死宣，富集了巨噬細(xì)胞M1、記憶激活T細(xì)胞和濾泡T輔助細(xì)胞（圖5a）碴开，METABRIC和TCGA隊(duì)列中CIBERSORT評(píng)分的分布也說明了這一點(diǎn)（圖5b）毅该。簇A如預(yù)期的那樣，免疫細(xì)胞的水平非常低潦牛。在反應(yīng)和預(yù)后較差的簇B中眶掌，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M2、靜止肥大細(xì)胞和靜止記憶T細(xì)胞的水平較高（圖5a巴碗，圖5b）朴爬。

使用廣義線性模型，指定了區(qū)分簇B與簇A-C的免疫細(xì)胞類型（圖5c）橡淆。還測(cè)試了哪些免疫細(xì)胞類型解釋了簇A與簇B之間的差異和簇B與簇C之間的差異召噩。

圖5 免疫簇的計(jì)算機(jī)剖析

08 - 免疫簇的表型分析

通過差異基因表達(dá)分析確定了簇B中顯著過度表達(dá)的基因，與簇A和簇C相比逸爵，簇B中有909個(gè)基因分別上調(diào)具滴。這些基因與干細(xì)胞生物學(xué)和EMT相關(guān)，如使用MsigDB31的H和C2集合的基因集富集分析（GSEA）所示（圖6a）痊银。

為了進(jìn)一步描述免疫簇與癌細(xì)胞表型之間的關(guān)系抵蚊，使用了與EMT、干細(xì)胞溯革、缺氧和增殖相關(guān)的基因集。使用GSVA方法計(jì)算了每個(gè)集群和隊(duì)列的平均基因集富集分?jǐn)?shù)谷醉，該分?jǐn)?shù)反映了免疫集群中每個(gè)路徑/基因集的活動(dòng)致稀。平均基因集分?jǐn)?shù)的無監(jiān)督聚類將免疫簇A和C分開，而簇B被分為兩個(gè)亞組（圖6b）俱尼。這些結(jié)果表明免疫簇與干細(xì)胞/EMT相關(guān)基因特征之間存在關(guān)聯(lián)抖单。

圖6 免疫簇與EMT和增殖有關(guān)，這是乳腺癌中兩種相互排斥的表型

通過GSVA富集分?jǐn)?shù)的無監(jiān)督聚類，確定了乳腺癌中兩個(gè)相互排斥的基因特征：（i）一個(gè)與增殖和胚胎干細(xì)胞樣表型相關(guān)矛绘，（ii）另一個(gè)與EMT和乳腺干細(xì)胞表型相關(guān)耍休。增殖表型在簇C中占主導(dǎo)地位（補(bǔ)充圖11A），當(dāng)計(jì)算每個(gè)代謝樣品的基因集得分時(shí)也觀察到了同樣的情況（補(bǔ)充圖11B）货矮。在簇B中羊精，EMT或增殖相關(guān)特征的平均基因集得分較高（補(bǔ)充圖11C）。在代謝物組的樣品水平上囚玫，我們觀察到一個(gè)或另一個(gè)狀態(tài)被激活的樣品的類似模式（補(bǔ)充圖11D）喧锦。簇A顯示EMT和增殖狀態(tài)得分較低（補(bǔ)充圖11E，F(xiàn)）抓督。

補(bǔ)充圖11 在每個(gè)免疫簇中富集的途徑

為了正式確定哪些基因集分?jǐn)?shù)解釋簇B燃少，使用廣義線性模型測(cè)試每個(gè)基因集的貢獻(xiàn)程度。EMT標(biāo)志對(duì)簇B有積極貢獻(xiàn)铃在，而增殖和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性與簇A和C相關(guān)（圖6c）阵具。還測(cè)試了當(dāng)單獨(dú)與簇A或簇C比較時(shí)，哪種基因集得分可以解釋簇B定铜。

09?- 腫瘤表型與免疫浸潤的相關(guān)性

由于免疫簇與（i）免疫細(xì)胞類型和（ii）基因集特征相關(guān)阳液，評(píng)估了免疫浸潤（CIBERSORT）和癌細(xì)胞特征（基因集分?jǐn)?shù)）之間的關(guān)系。圖6d顯示增殖和EMT分?jǐn)?shù)與不同類型的免疫細(xì)胞顯著相關(guān)宿稀。高EMT分?jǐn)?shù)與巨噬細(xì)胞M2趁舀、靜息肥大細(xì)胞和靜息記憶T細(xì)胞相關(guān)，而高增殖與更活躍的適應(yīng)性腫瘤微環(huán)境相關(guān)祝沸。這些數(shù)據(jù)表明癌細(xì)胞表型和腫瘤微環(huán)境的組成之間存在連續(xù)性矮烹。

簇B以致瘤免疫浸潤為主，EMT信號(hào)高罩锐，但約35%的簇B也表現(xiàn)為增殖表型奉狈。為了探索簇B中的這種異質(zhì)性，以無監(jiān)督的方式根據(jù)基因特征分?jǐn)?shù)將樣本分組為B1以EMT表型為主涩惑，B2以增殖為主（圖6e）仁期。

在METABRIC和TCGA中，具有增殖表型的B2病例的預(yù)后較差（圖6f竭恬，g）跛蛋。為了進(jìn)一步評(píng)估基因集評(píng)分的異質(zhì)性是否伴隨著免疫環(huán)境的異質(zhì)性，作者尋求B1和B2亞群之間特異性免疫細(xì)胞類型的差異痊硕。補(bǔ)充圖14中的無監(jiān)督聚類顯示赊级，兩個(gè)子聚類B1和B2都具有促腫瘤/靜息免疫微環(huán)境〔沓瘢總而言之理逊，簇B中兩種相互排斥的狀態(tài)可能與預(yù)后有關(guān)橡伞；然而，簇B的一個(gè)統(tǒng)一因素是存在促腫瘤/靜息免疫微環(huán)境晋被。

補(bǔ)充圖14 簇和亞簇的免疫浸潤

四兑徘、結(jié)論

在本研究中，發(fā)現(xiàn)了與臨床相關(guān)的免疫簇與漸進(jìn)性免疫浸潤羡洛。在15個(gè)乳腺癌隊(duì)列中挂脑，跨越6101個(gè)乳腺癌樣本，腫瘤免疫浸潤中等水平的患者群預(yù)后較差翘县，與已知的預(yù)后分子和臨床病理學(xué)特征無關(guān)最域。通過對(duì)群組免疫成分的表征，發(fā)現(xiàn)親腫瘤免疫浸潤與不良預(yù)后組相關(guān)锈麸。進(jìn)一步的表型分析顯示乳腺癌中存在兩種相互排斥的侵襲性腫瘤表型镀脂，一種與EMT有關(guān)，另一種與增殖有關(guān)忘伞。這兩種表型都是在不活躍/促腫瘤免疫微環(huán)境上發(fā)現(xiàn)的不良預(yù)后群薄翅。