轉(zhuǎn)自Seurat_Satija 如何使用 Seurat 分析單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)（ Q&A
1. 關(guān)于 QC
Q：過濾線粒體基因是去除低質(zhì)量 cell，核糖體基因用過濾嗎谈飒？
A： Seurat 教程中沒有提到用核糖體基因的 UMI 含量來過濾細(xì)胞烦绳，我看到的文獻(xiàn)中基本上也不這么做。單細(xì)胞中表達(dá)量最高的基因一般是線粒體基因椒涯、核糖體基因以及 actin 和 hemoglobin基因。有人認(rèn)為要去掉這些基因再做后續(xù)分析回梧，也有人說不要去掉废岂，沒有一個(gè)肯定的答案。
2. 關(guān)于 NORMALIZATION
Q： 請(qǐng)問不同樣本的測序深度用 NormalizeData 可以完全去除嗎狱意？ 樣本比較多的話湖苞，去除樣本測序深度推薦用 SCT 還是標(biāo)準(zhǔn)的 Normalize 方法呢？ / SCTransform 什么時(shí)間推薦使用详囤？
A： 在用 NormalizeData 函數(shù)做 normalization 的時(shí)候财骨， 每個(gè)細(xì)胞中所有基因的表達(dá)量除以該細(xì)胞中檢測到的所有 count 數(shù)， 這樣會(huì)使每個(gè)細(xì)胞所有基因的表達(dá)量之和都變得一樣，也就是說細(xì)胞之間的測序深度都保持一致隆箩。但是這樣做是否能夠完全去除測序深度對(duì)基因表達(dá)變異的影響该贾，還是要打個(gè)問號(hào)剧董。 根據(jù) Seurat 官網(wǎng)上的介紹： Even after standard log-normalization,variation in sequencing depth is still a confounding factor汹押， and this effect can subtly influence higher PCs。 因此错览， Seurat 又提供了 SCTransform 的方法娃属，并聲稱： In sctransform, this effect is substantially mitigated. This means that higher PCs are more likely to represent subtle, but biologically relevant, sources of heterogeneity – so including them may improve downstream analysis. 除了可以保留更多的生物學(xué)變異六荒， SCTransform 對(duì)參數(shù)的依賴度更小，產(chǎn)生的結(jié)果更穩(wěn)定矾端。 根據(jù)這些優(yōu)點(diǎn)掏击， Seurat 推薦使用 SCTransform 做 normalization。
Q： 使用 SCTransform 的時(shí)候秩铆， VlnPlot 所呈現(xiàn)的數(shù)值似乎會(huì)偏小砚亭，視覺上似乎較不明顯，請(qǐng)問是否會(huì)影響分析結(jié)果?
A： 這里所說的數(shù)值偏小殴玛，是指同一個(gè)基因捅膘，用 SCTransform 比用標(biāo)準(zhǔn)的 normalization 方法得到基因表達(dá)量偏小嗎？ 我覺得如果整體上基因的數(shù)值都偏大或偏小滚粟，應(yīng)該不會(huì)對(duì)后續(xù)分析有太大影響寻仗。不過，我還是建議你用兩種 normalization 方法都跑一遍完整的流程凡壤，看看結(jié)果會(huì)不會(huì)有很大差異署尤。
Q： Normalization 時(shí)，為什么要用 RPM 這種方式而不是像 DEseq2 計(jì)算 sizefactor 呢亚侠？
findmarker 時(shí)曹体，如果用 negativebinomial 這個(gè)模式，是用 count 數(shù)據(jù)硝烂，它會(huì)自己做
normalization 嗎箕别？
A： 在用 FinderMarkers 函數(shù)做差異表達(dá)分析的時(shí)候，如果選擇的是 DEseq2滞谢，函數(shù)內(nèi)部會(huì)使用estimateSizeFactor 函數(shù)計(jì)算 sizefactor串稀。 如果你使用的是 negbinom 檢驗(yàn)， FindMarkers 內(nèi)部調(diào)用的是 MASS::glm.nb 函數(shù)狮杨，但是我沒有在 Seurat 源代碼中看到在做這個(gè)檢驗(yàn)之前有normalization 的步驟母截。
3. 關(guān) 于 特 征 選 擇
Q： Findvariable 函數(shù)中 features 為什么要設(shè)置 2000？可以變嗎（彩環(huán) 田） / 想請(qǐng)問您對(duì)挑選特征基因有什么看法? 預(yù)設(shè) 2000 HVGs 適用于大型資料嗎禾酱？
A： FindVariableFeatures 函數(shù)有 3 種選擇高表達(dá)變異基因的方法，可以通過 selection.method參數(shù)來選擇，它們分別是： vst（默認(rèn)值）颤陶， mean.var.plot 和 dispersion颗管。 nfeatures 參數(shù)的默認(rèn)值是 2000，可以改變滓走。如果 selection.method 參數(shù)選擇的是 mean.var.plot垦江，就不需要人為規(guī)定高表達(dá)變異基因的數(shù)目，算法會(huì)自動(dòng)選擇合適的數(shù)目搅方。 我建議使用完 FindVariableFeatures 函數(shù)后比吭，用 VariableFeaturePlot 對(duì)這些高表達(dá)變異基因再做個(gè)可視化，看看使用默認(rèn)值 2000 會(huì)不會(huì)有問題姨涡。
Q：請(qǐng)問整合時(shí)衩藤，如果每個(gè)待整合樣本中的基因個(gè)數(shù)小于 2000，參數(shù) feature 該如何設(shè)置呢涛漂？
A： FindVariableFeatures 函數(shù)的 nfeatures 參數(shù)可以選擇各個(gè)樣本中基因數(shù)最小的那個(gè)值赏表，但是在此之前，建議你先確認(rèn)一下樣本中的基因數(shù)比較少的原因匈仗，樣本的質(zhì)量是否過關(guān)瓢剿， QC 過程中有沒有發(fā)現(xiàn)問題， subset 函數(shù)篩選的時(shí)候有沒有出錯(cuò)悠轩。
4. 關(guān)于細(xì)胞周期
Q： Cell Ranger 可以實(shí)現(xiàn)去除細(xì)胞周期影響嗎间狂？
A： Cell Ranger 不能去除細(xì)胞周期影響，建議你用 Seurat 讀入 Cell Ranger 的輸出文件火架，用CellCycleScoring 函數(shù)和 ScaleData 函數(shù)去除細(xì)胞周期影響鉴象。
Q: 請(qǐng)問能否再解釋下 兩種細(xì)胞周期去除方法的區(qū)別和意義？請(qǐng)問 scaledata 在去除細(xì)胞周期影響時(shí)候距潘，您剛才講過用 var.to.gress(S-G2M)炼列，或者 var.to.gress（ S， G2M） ,這兩種在意義上是什么區(qū)別音比？
A: 我們利用 ScaleData 函數(shù)的 vars.to.regress 參數(shù)來消除細(xì)胞周期帶來的變異俭尖。這里可以用到兩種方法，一種方法是同時(shí) regress out S.score 和 G2M.score洞翩，另一種方法是 regress out 兩個(gè)score 的差稽犁。從 PCA 圖上可以看到，第一種方法完全去除了細(xì)胞周期的影響骚亿，而第二種方法則消除了 S 和 G2M 期的差別已亥，為什么要這么做呢？因?yàn)閷?duì)于某些樣本來說来屠，有的細(xì)胞類型處于休眠期虑椎，有的細(xì)胞類型處于增殖期震鹉，如果把所有細(xì)胞周期的影響都去除掉，會(huì)影響這兩類細(xì)胞的鑒定捆姜。這時(shí)候传趾，我們只要去除增值期內(nèi)部細(xì)胞周期的差異，保留增值期和休眠期的差別就可以了泥技。
Q： findmarker 使用的是標(biāo)準(zhǔn)化的 slot浆兰， data 么？如果是珊豹，那之前 scale 中去除的細(xì)胞周期影響簸呈，是否還有意義？
A： 如果用細(xì)胞周期 marker 基因做 PCA 分析店茶，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以明顯按照細(xì)胞周期分為不同的group蜕便，說明細(xì)胞周期對(duì)這個(gè)數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)量有比較大的影響，用 ScaleData 函數(shù)去regress out 細(xì)胞周期 score 是十分必要的忽妒。 Findermaker 函數(shù)使用的是 data 值玩裙，不是scale.data。如果在做差異表達(dá)分析的時(shí)候也考慮細(xì)胞周期的影響段直，可以使用 metadata 中的Phase 變量吃溅，先篩選處于相同細(xì)胞周期的細(xì)胞再做差異表達(dá)分析。
Q： scale 里對(duì)細(xì)胞周期的矯正鸯檬，和 integrate 的整合矯正有哪些差異决侈？
A： 做細(xì)胞周期矯正，首先要有細(xì)胞周期 marker 基因喧务，然后用 CellCycleScoring 函數(shù)來計(jì)算細(xì)胞周期 score赖歌，然后用 ScaleData 函數(shù)去 regress out 細(xì)胞周期 score。 IntegrateData 主要是矯正多個(gè)樣本間的批次效應(yīng)功茴，例如整合多個(gè)來自不同單細(xì)胞測序技術(shù)的數(shù)據(jù)
5. 關(guān)于降維分析
Q: ElbowPlot 的拐點(diǎn)是指這個(gè)點(diǎn)后面基本持平了么庐冯？ / 請(qǐng)問如何判斷 elbow 拐點(diǎn)呢?為何不是在 3~4，而是在 9~10/ PC 拐點(diǎn)如何界定坎穿？
A： ElbowPlot 作圖后展父，用肉眼觀察，當(dāng)曲線進(jìn)入平臺(tái)期玲昧，沒有明顯繼續(xù)下降的趨勢就可以了栖茉。ElbowPlot 默認(rèn)顯示 20 個(gè) PC，如果發(fā)現(xiàn) 20 個(gè) PC 還沒有到達(dá)平臺(tái)期孵延，可以修改 ElbowPlot 函數(shù)的 ndims 參數(shù)吕漂。 RunPCA 函數(shù)默認(rèn)計(jì)算 50 個(gè) PC，如果想看更多的 PC尘应，可以修改 RunPCA 的npcs 參數(shù)惶凝。
Q：請(qǐng)問 PCA 那頁吼虎，是細(xì)胞和基因都做過 PCA 么？
A: 在 Seurat 中苍鲜，我們是對(duì)細(xì)胞做 PCA 分析鲸睛，也就是對(duì)細(xì)胞做降維分析，比如從 2000 維（基因）降到 50 維（ PC）坡贺。一般情況下，我們不會(huì)對(duì)基因做 PCA 分析箱舞。
Q： PCA 中的 embedding 可以再解釋下么遍坟？
A：比如，原本每個(gè)細(xì)胞有 2000 個(gè)基因晴股，每個(gè)基因在各個(gè)細(xì)胞中都有表達(dá)量愿伴，做了 PCA 分析后，每個(gè)細(xì)胞有 50 個(gè) PC电湘，每個(gè) PC 在各個(gè)細(xì)胞中都有 embedding 值隔节。為了便于理解，你可以把 PC 看成是整合了多個(gè)基因的 meta-gene寂呛，把 cell embedding 看成是這些 meta-gene 的表達(dá)量怎诫。
Q: 可不可以講下 umap 和 tSNE 的主要原理？
A: UMAP 和 tSNE 都是非線性的降維方法贷痪，是把在高維空間中的點(diǎn)（我們?nèi)祟惾庋蹮o法觀察）投射到二維平面上幻妓。這些高維空間中的點(diǎn)是有一定結(jié)構(gòu)的，有些點(diǎn)彼此之間距離更近劫拢，有些點(diǎn)距離更遠(yuǎn)肉津。我們?cè)诮稻S的過程要盡量保留這種結(jié)構(gòu)，讓在高維空間中更近的點(diǎn)舱沧，在二維平面上也更近妹沙，如果降維分析打亂了數(shù)據(jù)原有的結(jié)構(gòu)，就毫無意義了熟吏。 tSNE 的目標(biāo)是在降維的過程中盡量保留數(shù)據(jù)的局部結(jié)構(gòu)距糖，而 UMAP 除了能保留數(shù)據(jù)的局部結(jié)構(gòu)，還能更好的保留全局結(jié)構(gòu)分俯。如果想更深入的了解它們的原理肾筐，需要一定的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)，我推薦兩篇解釋的相對(duì)簡單一些的文章供你參考：
https://opentsne.readthedocs.io/en/latest/tsne_algorithm.html缸剪，
How UMAP Works - umap 0.4 documentation
Q: 我想問下數(shù)據(jù)降維為什么先做 PCA 然后再 UMAP 的降維 這倆不都是降維嗎吗铐？ 不能直接
UMAP？
A： PCA 分析和 UMAP 分析的目的不同杏节。 PCA 分析把高表達(dá)變異基因整合成若干個(gè) PC唬渗。這樣做一方面降維典阵，一方面降低噪音。做聚類分析和 UMAP 分析的時(shí)候镊逝，使用的不是基因表達(dá)量壮啊，而是由 PCA 分析得到的 PC 的值。 UMAP 的主要作用是把高維度中距離接近的點(diǎn)映射到二維平面上距離相近的位置上撑蒜。 UMAP 返回的結(jié)果只有兩個(gè)維度（ UMAP_1 和 UMAP_2）歹啼，只能用來做數(shù)據(jù)可視化。
6. 關(guān) 于 聚 類 分 析
Q: cluster ID 為何從 0 開始座菠？是否可以從 1 開始狸眼？從 0 開始是因?yàn)橛惺裁础惴ā矫嫣厥獾膬?yōu)勢么？
A： 默認(rèn) clusterID 是從 0 開始浴滴，沒有特殊的優(yōu)勢拓萌，可以使用 RenameIdents 函數(shù)重命名clusterID。
Q： 鑒定出來的細(xì)胞類群用 UMAP 繪圖后發(fā)現(xiàn)聚類效果很差升略，大量 cluster 相互交叉微王， 同一類群細(xì)胞彌散分布是什么原因？聚類可視化和類群劃分不匹配品嚣。
A： 首先要確保聚類和 UMAP 用的 dims 參數(shù)是一致的炕倘。可以適當(dāng)降低一下 FindClusters 函數(shù)的resolution 參數(shù)翰撑，減少 cluster 數(shù)目激才，看看能不能把相互交叉的 cluster 聚成一個(gè) cluster。 還可以嘗試 FindClusters 函數(shù)中不同的 algorithm 參數(shù)额嘿，看看聚類效果會(huì)不會(huì)改進(jìn)瘸恼。
Q： 請(qǐng)問分群過程中，是否有設(shè)置鄰居個(gè)數(shù)的函數(shù)和參數(shù)册养？
A： FinderNeighbors 函數(shù)的 k.param 參數(shù)是用來設(shè)置 KNN 算法中最近鄰的個(gè)數(shù)东帅。
Q： 請(qǐng)問 finder cluster 只能使用 SNN 進(jìn)行聚類么？可以有其他選擇嗎球拦？ / seurat 的聚類方式除了 KNN 外還有其他的選擇嗎靠闭？
A： Seurat 的聚類方法是基于 SNN 圖和 Louvain 或 SLM 算法， FindNeighbors 函數(shù)返回的SNN 圖是在 KNN 圖的基礎(chǔ)上得來的坎炼，不支持其他方法愧膀。
7. 關(guān) 于 數(shù) 據(jù) 整 合
Q：整合多樣本分析時(shí)，有些樣本細(xì)胞數(shù)量過少谣光，可能不足 200檩淋，這樣在整合數(shù)據(jù)時(shí)默認(rèn)參數(shù)就會(huì)報(bào)錯(cuò)，有什么好的建議嗎萄金？亞群細(xì)分時(shí)也經(jīng)常出現(xiàn)這個(gè)問題蟀悦，及個(gè)別樣本細(xì)胞數(shù)量過少媚朦，不能進(jìn)行批次校正/ 在對(duì)整合樣本中的某一細(xì)胞亞群進(jìn)行再次分群時(shí)，如果有些樣本中這一亞群的細(xì)胞比較少日戈，怎么進(jìn)行整合分析询张？
A：在不知道具體報(bào)錯(cuò)信息的情況下，我無法判斷問題的原因是由于細(xì)胞數(shù)目少還是來自樣本本身浙炼。 我的建議是： 首先要確定不足 200 個(gè)細(xì)胞的樣本是否都會(huì)遇到這個(gè)問題份氧。如果你在其他樣本中隨機(jī)抽取不到 200 個(gè)細(xì)胞，去做整合弯屈，也會(huì)報(bào)同樣的錯(cuò)誤嗎半火？ 如果給這些不足 200 個(gè)細(xì)胞的樣本逐漸增加細(xì)胞數(shù)，達(dá)到多少細(xì)胞數(shù)的時(shí)候季俩，就不會(huì)報(bào)錯(cuò)？
Q：請(qǐng)問整合時(shí)梅掠，報(bào)這樣的錯(cuò)該如何解決酌住？ ‘Error in irlba(A = t(x = object), nv =npcs, ...) :max(nu, nv) must be positive
A：我看不到你的代碼和數(shù)據(jù)，所以不好判斷是什么問題阎抒，有可能是輸入數(shù)據(jù)有問題酪我，你可以檢查一下輸入的數(shù)據(jù)是不是都做了相同的預(yù)處理，包括 normalization 的方法和高變基因的數(shù)目等等且叁，再看看 FindIntegrationAnchors 和 IntegrateData 函數(shù)中選擇的 dims 參數(shù)是否一致都哭。如果你整合的樣本比較多，可以先拿兩個(gè)樣本來整合逞带，如果成功欺矫，再繼續(xù)增加樣本，直到報(bào)錯(cuò)展氓，就可以定位是哪個(gè)數(shù)據(jù)出了問題穆趴。
Q：在整合多個(gè)樣品的單細(xì)胞數(shù)據(jù)時(shí)系統(tǒng)報(bào)錯(cuò)，說超過內(nèi)存怎么辦遇汞？我們的樣品大約有 20 多個(gè)/ 在整合多個(gè)樣本數(shù)據(jù)時(shí)未妹，由于樣本量過大，導(dǎo)致超過稀疏矩陣上限空入，無法進(jìn)行 integrateData步驟络它，應(yīng)如何解決？
A：我也會(huì)經(jīng)常遇到數(shù)據(jù)量超過內(nèi)存上限的問題歪赢，解決辦法就是換一個(gè)有更大內(nèi)存的服務(wù)器化戳，此外，在做數(shù)據(jù)分析的過程中埋凯，經(jīng)常查看當(dāng)前環(huán)境中的數(shù)據(jù)占用了多大內(nèi)存迂烁，及時(shí)清理一些中間變量看尼，刪除之前最好將一些重要的變量保存在 RDS 文件里。如果這些方法都不行盟步，就只好對(duì)樣本中的細(xì)胞隨機(jī)抽樣藏斩，選取一部分細(xì)胞來做整合。
Q：樣本之間如果沒有 batch effect,可以用直接 merge 合并嗎却盘？ / 我們可不可以直接把多個(gè)sample 直接合并不用 intergation 函數(shù)如果沒看出有 batch effect/ 關(guān)于樣本整合狰域， merge 函數(shù)可以用嗎？
A：關(guān)于樣本整合黄橘，建議使用 Seurat 提供的 FindIntegrationAnchors 和 IntegrateData 函數(shù)兆览。merge 函數(shù)只是合并多個(gè) Seurat 對(duì)象，無法消除批次效應(yīng)塞关。如果你的數(shù)據(jù)沒有批次效應(yīng)抬探，merge 也是可以用的。
Q：多個(gè)樣本整合后的細(xì)胞分群結(jié)果是不是可能和單個(gè)樣本做細(xì)胞分群結(jié)果會(huì)不一致帆赢？
A： 這是很有可能的小压。比如一個(gè)樣本中某種細(xì)胞的含量很少，它們有可能和其他類型的細(xì)胞聚在一起椰于，但是另一個(gè)樣本中該類細(xì)胞的含量比較多怠益，當(dāng)兩個(gè)樣本整合在一起后， 兩個(gè)樣本中的這類細(xì)胞應(yīng)該更傾向于聚在一起瘾婿，這樣就和單個(gè)樣本做細(xì)胞分群的結(jié)果不一致蜻牢。這只是我的假設(shè)，我沒有用實(shí)際數(shù)據(jù)去驗(yàn)證過這種不一致的程度有多大偏陪，和哪些因素有關(guān)抢呆。你如果有這樣的數(shù)據(jù)可以嘗試分析一下。
Q： 對(duì)于不同時(shí)間笛谦，同樣用 10X 處理的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組樣本镀娶，但是測序飽和度不同，必須用integration 方法進(jìn)行批次效應(yīng)處理么揪罕？還是說直接合并就可以了梯码？ / 請(qǐng)問多個(gè)發(fā)育時(shí)期的樣本需要整合流程嗎？
A： 首先要判斷樣本之間是否有批次效應(yīng)好啰。一般是做一個(gè) tSNE 或 UMAP 圖轩娶，如果來自同一個(gè)樣本的細(xì)胞都聚在一起，來自不同的樣本的細(xì)胞都分的很開框往，說明批次效應(yīng)明顯鳄抒，需要用integration 的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)整合。整合完成后再做一個(gè) tSNE 或 UMAP 圖，查看批次效應(yīng)是否已經(jīng)去除许溅。如果沒有批次效應(yīng)瓤鼻，直接 merge 也是可以的。 如果在 tSNE 或 UMAP 圖上不容易判斷是否有批次效應(yīng)贤重，建議兩種方法都試一下茬祷，看看最后的結(jié)果有沒有很大差異。
Q： 多樣本整合是按樣本來整合嗎并蝗？ 還是按不同樣本類型來整合祭犯？
A： Seurat 可以整合不同的樣本類型，比如 scRNA-seq 和 CITE-seq 的整合滚停， 以及 scRNA-seq和 scATAC-seq 的整合沃粗。可以參考 2019 年的那篇 Cell 文章键畴。
Q： CITE-seq 用 seurat 分析如何將多個(gè)樣本合并呢最盅？
A： 將 CITE-seq 的 ADT 數(shù)據(jù)存放在 Assay 對(duì)象中，并設(shè)置為默認(rèn) assay起惕，然后用和 scRNA-seq一樣的方法整合數(shù)據(jù)涡贱。
Q： 整合會(huì)不會(huì)把樣本間的部分差異當(dāng)成批次效應(yīng)給去除掉？
A：我覺得是有可能的疤祭，這種“矯枉過正”的程度有多大是和樣本之間本身的差異有關(guān)的《牛可以設(shè)想一下勺馆，如果把 PBMC 的樣本和神經(jīng)細(xì)胞的樣本放在一起整合會(huì)是什么效果。這兩個(gè)樣本的生物學(xué)差異應(yīng)該大于批次效應(yīng)侨核，這時(shí)候去批次效應(yīng)就有可能把樣本間的部分差異也去除掉了草穆。 這只是我的推測，并沒有用數(shù)據(jù)驗(yàn)證過搓译，僅供參考悲柱。
Q： 如果不進(jìn)行 intergration ,可以直接比較 control 和疾病組的差異嗎？整合的優(yōu)勢是統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化嗎些己？
A：如果是 bulk RNA-seq豌鸡，可以直接比較 control 和疾病組的差異。 但是 bulk RNA-seq 中基因的表達(dá)量是基因在所有細(xì)胞中表達(dá)量的平均值段标，沒有考慮到樣本中細(xì)胞的異質(zhì)性涯冠，某個(gè)基因在某種細(xì)胞類型中的差異表達(dá)有可能被樣本中細(xì)胞類型的差異所掩蓋。因此逼庞， 我們要利用單細(xì)胞RNA-seq蛇更，找到兩個(gè)樣本中相同類型的細(xì)胞后，再尋找這類細(xì)胞在 control 和疾病組的差異表達(dá)基因。具體來說派任，我們利用 Seurat 整合完 control 和疾病組樣本砸逊，并做聚類分析后，分別在control 和疾病組中對(duì)某個(gè) cluster 做差異表達(dá)分析掌逛，尋找這個(gè) cluster 的 marker 基因师逸，然后，把在 control 和疾病組中都被鑒定為 marker 基因的基因颤诀， 作為該 cluster 保守的 marker 基因字旭，并利用這些基因?qū)?xì)胞類型進(jìn)行注釋。最后崖叫，針對(duì)同一類細(xì)胞遗淳，尋找在 control 和疾病組中發(fā)生變化的基因。
Q： 如果我想對(duì)某種細(xì)胞分亞群心傀，是用經(jīng) PCA 和的 seurat 對(duì)象取出這部分細(xì)胞聚類屈暗，還是需要重新整合，或者重新 PCA脂男？
A： 在分亞群的時(shí)候养叛，很多人都會(huì)遇到類似的問題。在 GitHub 上也有很多討論：
re_clustering in seurat v3 · Issue #1528 · satijalab/seurat
How to analysis the subset cells of already intergrated object? · Issue #1547 · satijalab/seurat
但是宰翅，目前還沒有看到 Seurat 官方給出的最佳實(shí)踐弃甥。我的建議是在分亞群之前，先在 UMAP 圖上看看有沒有 batch effect汁讼，如果沒有淆攻，就不需要重新整合。
8. 關(guān) 于 差 異 表 達(dá) 分 析
Q： 老師您好嘿架，請(qǐng)問差異分析為什么使用 RNA assay ?而不是用 SCT assay 或者 Integratedassay瓶珊？ RNA assay 不是未經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化和批次校正的原始數(shù)據(jù)么? / 整合數(shù)據(jù)后進(jìn)行 findmarker分析時(shí)是采用 integrated assay 還是 RNA assay？
A： 這個(gè)問題也困擾了我很久耸彪，后來我在 GitHub 上找到了官方的解釋： As a general rule, wealways recommend performing DE on originally measured values - instead of on batchcorrected, imputed, etc. values. This ensures that the measurements that enter the DE test are indeed independent from each other, which is a requirement of any statistical DE test. Find DEGs after doing integration · Issue #1256 · satijalab/seurat
Q： 得到的差異基因和保守基因伞芹，用哪個(gè)作為 marker 基因好？ / FindallMarkers 和findconservedmarkers 結(jié)果上有什么區(qū)別嗎蝉娜？
A： 如果只有一個(gè)樣本唱较，就用 cluster 中的差異表達(dá)基因做 marker 基因。如果做了數(shù)據(jù)整合召川，比如處理組和對(duì)照組绊汹，就要先用 FindConservedMarkers 函數(shù)找到保守的差異表達(dá)基因，用它們來作為 marker 基因?qū)?cluster 做注釋扮宠，注釋完以后西乖，再用 FindMarkers 函數(shù)比較這個(gè) cluster 中的處理組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因狐榔。
Q： 如果想從所有基因中篩選差異基因，有方法能實(shí)現(xiàn)么获雕？
A： 在用 FindMarkers 函數(shù)找差異表達(dá)基因的時(shí)候薄腻， 可以通過 logfc.threshold（默認(rèn)值 0.25），min.pct（默認(rèn)值 0.1）和 min.diff.pct（默認(rèn)值-Inf）三個(gè)參數(shù)來預(yù)篩選基因届案，這樣可以加快計(jì)算速度庵楷，如果想從所有基因中篩選差異基因，就把 logfc.threshold 設(shè)為 0楣颠， min.pct 設(shè)為 0尽纽。
9. 關(guān)于細(xì)胞注釋
Q： cluster 名稱的命名主要參考哪幾方面的信息（如 cluster 的 top makers）？
A：對(duì) cluster 進(jìn)行注釋童漩，主要是看 FindMarkers 或 FindAllMarkers 函數(shù)找到的 marker 基因弄贿。利用已有的知識(shí)或者數(shù)據(jù)庫，將 cluster 命名為特定的細(xì)胞類型矫膨。有幾個(gè)細(xì)胞 marker 基因的數(shù)據(jù)庫供參考：
CellMarker： CellMarker
PanglaoDB： A Single Cell Sequencing Resource For Gene Expression Data
Q： 您可以再詳細(xì)講一下如何自動(dòng)的識(shí)別細(xì)胞類型嗎差凹？
A：首先是用 FindIntegrationAnchors 函數(shù)找到數(shù)據(jù)集間的錨點(diǎn)，然后用 IntegrateData 函數(shù)整合多個(gè)數(shù)據(jù)集侧馅。這個(gè)數(shù)據(jù)集可以用來研究處理組和對(duì)照組的變化危尿。如果這個(gè)數(shù)據(jù)集有細(xì)胞類型的注釋信息，就可以拿來作為參考數(shù)據(jù)集馁痴，對(duì)查詢數(shù)據(jù)集進(jìn)行細(xì)胞類型的注釋谊娇。方法也很簡單，先使用 FindTransferAnchors 函數(shù)罗晕，找到參考數(shù)據(jù)集和查詢數(shù)據(jù)集的錨點(diǎn)济欢，然后使用TransferData 函數(shù)和參考數(shù)據(jù)集的標(biāo)簽對(duì)查詢數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞進(jìn)行注釋，每個(gè)細(xì)胞都有一個(gè)預(yù)測的細(xì)胞類型以及打分攀例。這個(gè)預(yù)測信息可以用 AddMetaData 函數(shù)添加到查詢數(shù)據(jù)集的metadata 中船逮。
Q：請(qǐng)問癌癥單細(xì)胞分群后注釋顾腊，怎么區(qū)分惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞群粤铭？
A： 我所知道的方法有兩種，一種是看 marker 基因杂靶，另一種是用基因表達(dá)數(shù)據(jù)推斷 CNV梆惯。 給你兩篇文獻(xiàn)供參考：
(1) Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer.
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31270-9
(2) Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming ofmetastatic lung adenocarcinoma.
http://www.nature.com/articles/s41
原文：如何使用 Seurat 分析單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)（ Q&A）-上 - 知乎 (zhihu.com)
