ChIP實驗
ChIP實驗成功的三大關(guān)鍵因素
1惧磺、交聯(lián)條件的優(yōu)化
組織和細胞甲醛固定交聯(lián)的化學(xué)本質(zhì)是蛋白和DNA交聯(lián)形成可逆共價鍵（在核苷酸和氨基酸之間）逃呼。
所用的甲醛終濃度約為1%辙售，而交聯(lián)時間需要預(yù)實驗來確定存和。通常的交聯(lián)條件為室溫10分鐘烟逊。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的交聯(lián)終止劑終止姐帚。交聯(lián)時間如果過長吏垮，細胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果罐旗，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失膳汪。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全九秀，實驗中容易丟失目的蛋白遗嗽，產(chǎn)生假陰性。
這里以上圖擬南芥為例鼓蜒，甲醛在組織中的有效滲透對于ChIP實驗至關(guān)重要（本實驗指南適用于動物樣本和植物樣本痹换，此處僅以擬南芥組織直觀舉例。）
（A） 在交聯(lián)步驟之前都弹，植物材料漂浮在溶液表面并被小氣泡覆蓋娇豫；葉片的背面和正面在顏色上不同。
（B） 固定后畅厢，植株應(yīng)明顯浸泡在溶液中冯痢，略透明，并均勻地浸泡在交聯(lián)溶液中。
2浦楣、超聲或酶切后DNA片段的大小質(zhì)控和優(yōu)化
打斷后的染色質(zhì)片段的長度應(yīng)主要集中在200-1000bp左右袖肥。
溫馨提示：進一步的片段長度要求如下
1）如果下游銜接的是NGS二代測序，那么DNA片段長度集中在200-500 nt左右更好振劳。
2）如果下游銜接的是熒光定量PCR椎组，那么DNA片段長度集中在300-1000 nt左右更好。
上圖為使用MNase酶切染色質(zhì)后得到的DNA小片段2%瓊脂糖電泳后的條帶圖
上圖為使用超聲打斷染色質(zhì)后得到的DNA小片段（經(jīng)過不同超聲條件的優(yōu)化）
注意：超聲打斷和酶切切斷的條件需要做預(yù)實驗優(yōu)化
1）超聲波是使用機械力斷裂染色質(zhì)历恐，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫寸癌，這都會引起蛋白質(zhì)變性，進而影響ChIP的效率夹供。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時灵份，要在冰上進行，且要設(shè)計時斷時續(xù)的超聲程序哮洽，保證低溫填渠。總超聲時間也不要太長鸟辅，以免蛋白降解氛什。超聲打斷染色質(zhì)的程序和時間也需要根據(jù)不同的超聲儀做預(yù)實驗來確定最佳條件，不然打斷程度不同匪凉，得到的染色質(zhì)片段大小也不同枪眉。
2）MNase酶切染色質(zhì)的用量和時間也需要做預(yù)實驗來確定最佳條件，不然酶切消化程度不同再层，得到的染色質(zhì)片段大小也不同贸铜。
3、抗體與目的蛋白結(jié)合的有效性和特異性
ChIP所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關(guān)鍵聂受。因為在蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時蒿秦，蛋白的抗原表位可能被結(jié)合位點處其他染色質(zhì)蛋白造成的空間位阻所干擾而不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物蛋济，直接影響ChIP的結(jié)果棍鳖。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時碗旅，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀IP檢測渡处。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗的檢測祟辟。另外：當使用乙跻教保化組蛋白抗體時，需要阻止去乙醮猓化的發(fā)生登下，因此在整個染色質(zhì)提取過程中茫孔，5 mM的丁酸鈉有必要存在于所有的溶液中叮喳。
建議優(yōu)先使用Engibody的IF0002被芳。
特點如下：
? IF0002 (ChIP級ProteinA/G 磁珠)已經(jīng)經(jīng)過了BSA蛋白和單鏈鮭魚精DNA的預(yù)包被處理，極大降低了實驗中非特異性吸附DNA作用帶來的假陽性和背景信號馍悟。
? 此磁珠偶聯(lián)的Protein A和Protein G不是簡單的混合在一起的畔濒，而是一個融合表達分子，將兩種分子的優(yōu)勢集于一身锣咒，可以對實驗中絕大部分種屬來源的抗體都有很高的親和力侵状，能強力捕獲常見的兔源抗體、小鼠源抗體毅整、山羊源抗體趣兄、綿羊源抗體、人源抗體及大鼠源抗體等悼嫉。
? 此磁珠從4℃中取出艇潭，需要在室溫平衡30分鐘方可使用，不可高速離心戏蔑，不可冷凍蹋凝。并且必須在充分混勻重懸后快速吸出使用，以免磁珠沉降后吸出的懸液和理論量不符总棵。
那么有個問題
問題：當目的蛋白實在找不到合適的ChIP級抗體時鳍寂，怎么辦？
回答：采用ChIP級Flag/GFP單純抗體或是ChIP級Flag/GFP羊駝納米抗體偶聯(lián)Beads
當目的蛋白實在找不到合適的抗體時情龄，可以嘗試將GFP或FLAG等標簽序列融合表達在目的蛋白的N端或是C端迄汛，構(gòu)建表達載體轉(zhuǎn)染細胞后表達出GFP或FLAG目的蛋白，然后采用抗GFP或FLAG的ChIP級抗體（或是GFP羊駝納米抗體偶聯(lián)的beads）免疫沉淀GFP或FLAG目的蛋白骤视，從而間接實施了目的蛋白的ChIP實驗鞍爱。
4、DNA結(jié)合蛋白尤其轉(zhuǎn)錄因子TF的磷酸化修飾的保留
通常轉(zhuǎn)錄因子在得到信號通路上游調(diào)控分子促成的磷酸化修飾之后尚胞，才能進入細胞核硬霍，并結(jié)合到啟動子DNA元件上，因此笼裳，在制備蛋白樣本時一定要注意采用適當藥物或是條件促使目的細胞或組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子進行磷酸化修飾唯卖，同時，使用蛋白磷酸酶抑制劑處理樣本躬柬，盡量保留這種磷酸化修飾拜轨。
實驗前準備
試劑準備
? 試劑盒中磁珠需要從4度冰箱中取出，室溫平衡30分鐘允青，切記不可冷凍橄碾。
? 4℃中存放的試劑若有白色絮狀物析出為正常現(xiàn)象，請恢復(fù)至室溫或是37℃預(yù)熱即可溶解消失法牲。
? 本文后述Protocol中每種試劑的量都是單個樣本的用量史汗，實驗前需要根據(jù)自己的實驗分組計算多個樣本的整體用量。
樣本準備
? 動物細胞：每個樣本1000萬個(一個15cm培養(yǎng)皿在細胞生長匯合至80%-90%時的細胞數(shù)量)
? 動物內(nèi)臟組織：每個樣本200 mg左右, 新鮮組織或超低溫保存的凍存組織均可
? 植物幼嫩組織：每個樣本300-500 mg左右, 新鮮組織或超低溫保存的凍存組織均可
注意：樣本制備中一定要使用蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑拒垃，尤其是磷酸酶抑制劑對保留目的蛋白的磷酸化狀態(tài)至關(guān)重要停撞。
實驗操作步驟如下：
Step 1：樣本處理——貼壁細胞、懸浮細胞悼瓮、動物組織戈毒、植物組織
1.1、貼壁培養(yǎng)細胞和懸浮培養(yǎng)細胞可以直接進入下一步Step 2横堡，無需額外處理埋市；
1.2、植物組織和動物組織都需要在冰上置于干凈培養(yǎng)皿中迅速用小剪刀將組織剪碎命贴、切割成毫米級的小碎塊道宅，并轉(zhuǎn)入50mL離心管中待用；
注意：剪碎組織需要在冰上操作套么，且時間不宜超過20分鐘培己，以防止蛋白質(zhì)降解。
Step 2：DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)并提取染色質(zhì)
2.1胚泌、甲醛固定交聯(lián)
注意：
對于靶蛋白為組蛋白類的ChIP實驗樣本省咨，由于DNA纏繞在組蛋白上，結(jié)合較為牢固玷室，所以這類樣本無需交聯(lián)零蓉，直接收集細胞或組織，然后進入下一步Step 2.2穷缤。
對于轉(zhuǎn)錄因子為代表的DNA和蛋白弱結(jié)合類的ChIP實驗樣本敌蜂，則需要先進行甲醛交聯(lián)，固定DNA和蛋白的復(fù)合物津肛，步驟如下：
細胞交聯(lián)
A章喉、為了使蛋白與DNA交聯(lián)，向每個含有20 mL培養(yǎng)基的15cm貼壁細胞培養(yǎng)皿或懸浮細胞培養(yǎng)瓶中逐滴加入540 μL的37%新鮮甲醛溶液身坐。稍加轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使之混勻秸脱，室溫放置10分鐘。
※甲醛的工作終濃度為1%
※加入甲醛后部蛇，培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變
※使用新鮮未過產(chǎn)品保質(zhì)期的甲醛溶液
B摊唇、每個培養(yǎng)皿中加入2mL的10×交聯(lián)終止劑，稍加轉(zhuǎn)動使之混勻涯鲁，室溫孵育5分鐘巷查。
※加入交聯(lián)終止劑后有序，培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變
C、對于貼壁細胞岛请，直接棄去培養(yǎng)基后用冰冷的PBS漂洗兩次(10 mL/次)旭寿， 徹底吸棄PBS。對于懸浮細胞髓需，4°C许师，1000 g離心5分鐘房蝉，細胞沉淀用冰冷的PBS重懸漂洗兩次僚匆，徹底吸棄PBS。
D搭幻、貼壁細胞每皿中加入5 mL冰冷1×PBS（需要用前加入新鮮的蛋白酶抑制劑）咧擂，用細胞刮將細胞刮下并收集到一個15 mL的離心管中。再次加入3 mL冰冷1×PBS到培養(yǎng)皿中檀蹋，將剩余的細胞也徹底刮下松申，然后合并到第一次刮下的5mL細胞懸液中。4°C俯逾，1000 g離心5分鐘贸桶。小心吸棄上清，得到細胞沉淀桌肴，置冰上待下一步裂解提取染色質(zhì)之用皇筛。
懸浮細胞也是按照上述方法收集細胞沉淀，置于冰上坠七，待下一步裂解提取染色質(zhì)之用水醋。
組織交聯(lián)
A、在前述步驟中剪碎處理好的毫米級組織塊中加入20 mL 1×PBS（含有540 μL 37%甲醛彪置，甲醛工作終濃度為1%）并重懸組織塊拄踪；置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫交聯(lián)10-20分鐘拳魁；
B惶桐、加入2 mL 10×交聯(lián)終止劑，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上潘懊，室溫姚糊，終止交聯(lián)反應(yīng)，5分鐘卦尊；
C叛拷、1000g、4℃離心5分鐘岂却，棄上清忿薇，收集沉淀裙椭；
D、加10 mL預(yù)冷1×PBS署浩，洗滌兩次沉淀揉燃，每次4℃，1000 g離心5分鐘收集沉淀筋栋。
注意：對于植物組織而言炊汤，因為有細胞壁的阻隔，所以相對于動物組織更需要優(yōu)化交聯(lián)的時間和條件（甚至可以采用真空交聯(lián)）弊攘。
2.2抢腐、細胞裂解及染色質(zhì)提取
注意：根據(jù)不同靶蛋白特點選擇的技術(shù)路線不同，此時的樣本處于無需交聯(lián)或是已經(jīng)交聯(lián)的狀態(tài)襟交。
開始之前：
? Kit中的Chromatin Extract Buffer中需要預(yù)冷迈倍，并在使用前加入新鮮配制的蛋白酶抑制劑（需要自備）和TCEP（Kit中含有）。
? 取出并預(yù)熱實驗者自備的Protease Inhibitor Cocktail (必須是無EDTA的)捣域，使用前確保它完全融化啼染，不過更建議使用羅氏的無EDTA蛋白酶抑制劑（貨號在前文自備試劑清單里），現(xiàn)場將其片劑溶解成25×濃縮液備用焕梅。
? 配制1 M TCEP (572mg TCEP+ 2mL dH2O)迹鹅，確保TCEP固體完全溶解。一旦配制成溶液贞言，需將 1 M TCEP 置于 -20℃下存放斜棚，此為20×濃縮液，可以短期儲存?zhèn)溆梦献帧CEP在Chromatin Extract Buffer中的工作終濃度為50m mol/L打肝，根據(jù)工作終濃度來計算所取Chromatin Extract Buffer中需要加入的TCEP濃縮液的量。
? 研缽要預(yù)冷（用于植物組織樣本）
? Dounce杜恩斯勻漿器要預(yù)冷（用于動物內(nèi)臟組織樣本挪捕，肌肉組織也可嘗試研缽）
? 組織勻漿液如果含有固體雜質(zhì)過多粗梭，可以使用細胞篩網(wǎng)進行過濾除去。?
? 對于每個細胞樣本级零，在上一步驟中得到的細胞沉淀中加入1mL的Chromatin Extract
Buffer, 置于冰上孵育10分鐘断医，每2分鐘顛倒混勻一次。
? 對于每個動物組織樣本奏纪，將上一步驟中得到的微小組織塊沉淀轉(zhuǎn)移到Dounce玻璃勻漿器中鉴嗤，加入1mL的Chromatin Extract Buffer進行充分勻漿。
? 對于每個植物組織樣本序调，將上一步驟中得到的微小組織塊沉淀轉(zhuǎn)移到研缽中醉锅，加入1mL的Chromatin Extract Buffer進行充分勻漿。
Step 3：染色質(zhì)片段化——超聲法或酶切法
注意：
? 甲醛交聯(lián)處理的樣本必須采用超聲法才能有效打斷染色質(zhì)发绢；
? 未經(jīng)過甲醛交聯(lián)處理的樣本可以采用超聲法或酶切法切斷染色質(zhì)硬耍；
? ChIP-Seq 要求超聲后的片段大小在200-600 bp 之間垄琐；
? ChIP-qPCR 要求超聲后的片段大小在300-1000 bp 之間；
Option A: 超聲隨機打斷法
收集上一步驟Step 2中的細胞裂解液或組織勻漿液经柴，直接進行如下超聲打斷流程狸窘。
A、非接觸式全自動超聲波破碎儀坯认，高功率翻擒，30秒+30秒，超聲28 cycles牛哺÷或接觸式超聲儀230W功率，工作2秒+停止5秒荆隘，總時長15 分鐘左右恩伺；
B、超聲處理完成后椰拒，在 4°C 下按照13,000 g 的轉(zhuǎn)速離心 10 分鐘，沉淀細胞碎片上沐，將約1 mL的上清(總?cè)旧|(zhì)片段混合物)轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中首昔；
C拟蜻、將得到的約1 mL總?cè)旧|(zhì)片段一分為四。
具體方法：吸出1%（即10μL）到Input管（Input管會在后續(xù)步驟Step 4.8中用到）缆毁，再吸出50μL 另置一管，作為酶切質(zhì)控的樣本到涂。剩余的均分到Anti-target管和IgG管脊框，每管約470μL左右。這四管樣本均置于冰上践啄，所有樣本都這樣處理好浇雹，準備進入下一步驟Step 4結(jié)合一抗和Protein A/G磁珠正式進行免疫沉淀。
注意：
1屿讽、超聲過程中應(yīng)避免樣本發(fā)熱昭灵，可以斷斷續(xù)續(xù)超聲，發(fā)熱可能會使靶蛋白變性伐谈。
2烂完、片段大小隨著超聲時間的增加而減小，但超聲處理時間過長會破壞核小體-DNA 相互作用诵棵，因此條帶大小應(yīng)不小于 200 bp抠蚣。
Option B: 酶切法
酶切法的原理如下圖所示：
這是微球菌核酸酶MNase徹底消化染色質(zhì)的最終狀態(tài)
注意：
實際上都消化成單個核小體并不符合ChIP實驗要求，應(yīng)該消化為1-5個核小體之間履澳，200nt - 1000nt的片段長度嘶窄，更準確地說是：如果下游實驗是NGS二代測序缓屠，那么DNA片段長度應(yīng)在200-500 nt左右。如果下游是熒光定量PCR护侮，那么長度集中在300-1000 nt左右更好敌完。
開始之前：預(yù)冷1×TBS
A、收集上一步驟Step 2中的細胞裂解液或組織勻漿液于1.5 mL離心管中羊初，4℃滨溉，10000 g，離心5分鐘得到染色質(zhì)沉淀长赞，吸棄上清晦攒，加入120 μL的1× Cleavage Buffer，移液器吸吹重懸得哆。
B脯颜、每個樣本管內(nèi)加入1.25 μL的微球菌核酸酶MNase，移液器吸吹混勻數(shù)次贩据，37℃孵育20分鐘栋操。每隔3-5分鐘吸吹混勻一次，將染色質(zhì)酶切為符合要求的小片段饱亮。
注意：不同的細胞系矾芙，將其DNA片段化成理想長度所需的MNase量有所差別，可通過預(yù)實驗確定所需酶的用量和時間近上。
C剔宪、在每管中加入60 μL的0.5M 酶切終止劑，終止酶切反應(yīng)后壹无，每管加入820 μL的1×TBS稀釋至1 mL總體積葱绒。
D、酶切后反應(yīng)液在4℃斗锭，13000 g下地淀，離心10分鐘，將上清(總?cè)旧|(zhì)片段混合物)轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中拒迅；
E骚秦、將得到的約1 mL總?cè)旧|(zhì)片段一分為四。
具體方法：吸出1%（即10μL）到Input管（Input管會在后續(xù)步驟Step 4.8中用到）璧微，再吸出50μL另置一管作箍，作為酶切質(zhì)控的樣本。剩余的均分到Anti-target管和IgG管前硫，每管約470μL左右胞得。這四管樣本均置于冰上，所有樣本都這樣處理好屹电，準備進入下一步驟Step 4結(jié)合一抗和Protein A/G磁珠正式進行免疫沉淀阶剑。
注意：
實驗做到這里跃巡，是不是大家都迫不及待想把用于染色質(zhì)片段化質(zhì)控的那50μL樣本跑個瓊脂糖凝膠電泳，看看DNA片段條帶的大小分布是什么樣子的呢牧愁？
答案是不可以
因為這時得到的仍然是染色質(zhì)片段素邪，DNA上還有結(jié)合的蛋白（組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子猪半、DNA修復(fù)因子兔朦、染色質(zhì)重塑因子等等），這樣的蛋白-DNA復(fù)合物還不能直接用于瓊脂糖凝膠電泳磨确。還需要進行下面的處理流程沽甥，去除樣本中的游離RNA和結(jié)合在DNA上的各種蛋白，得到純凈的DNA片段后才能用于瓊脂糖凝膠電泳乏奥。
染色質(zhì)片段化質(zhì)控的處理方法
1摆舟、向50μL的梁色質(zhì)片段樣品中(來自上一步驟超聲法或是酶切法中分出的專門用于質(zhì)控的50μL樣本)加入100μL無核酸酶的水、10μL的ChIP專用鹽溶液和2μL的RNase A邓了。渦旋震蕩混勻恨诱，37°C孵育30分鐘。
2驶悟、向RNase A消化后的每管樣品中加入2 μL蛋白酶K胡野。 渦旋震蕩混勻，55°C孵育2個小時痕鳍。
3、使用后文Step 5步驟中的DNA純化步驟來純化每管中的DNA片段(可選步驟)龙巨。
4笼呆、DNA樣品純化后，每個樣本取10μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳以確定DNA片段大小旨别。DNA應(yīng)當被酶切或是超聲打斷成長度約為200-1000bp的片段(1~5個核小體長度)诗赌。
5、測定DNA濃度時秸弛，將2 μL純化后的DNA加入到98 μL TE緩沖液中(即稀釋50倍)铭若，然后讀取OD260吸收值。將OD260吸收值乘以2500即得到 以μg/mL表示的DNA濃度递览。理想的DNA濃度應(yīng)當在100~200 μg/mL之間叼屠。
6、當電泳結(jié)果顯示的片段大小處在符合實驗要求的范圍內(nèi)绞铃，才可以進入下一步Step 4免疫沉淀實驗镜雨。如果DNA片段大小不符合實驗要求，則需要重新優(yōu)化片段化的處理條件儿捧，直到符合要求荚坞。
溫馨解惑：
為什么使用RNase?A挑宠？
上述用于質(zhì)控DNA片段長度的樣本在蛋白酶K消化后得到游離DNA片段，可以直接用于瓊脂糖凝膠電泳颓影，也可以使用DNA純化試劑進一步的純化后再電泳各淀，在DNA純化過程中高豐度的RNA會干擾目的DNA純化，因此需要使用 RNase A 處理樣本诡挂，否則純化步驟會被RNA干擾而導(dǎo)致DNA產(chǎn)物大大減少碎浇。同時去除RNA也可以減少對DNA瓊脂糖電泳的干擾。
為什么使用蛋白酶 K咆畏？
用蛋白酶 K處理樣本南捂，可使鄰近脂肪與芳香族氨基酸羧基的肽鍵斷裂。消化結(jié)合在DNA上的蛋白質(zhì)旧找，促進 DNA 的純化溺健。
Step 4：染色質(zhì)免疫沉淀——捕獲、洗滌钮蛛、洗脫并解交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物
上圖為兩種染色質(zhì)免疫沉淀復(fù)合物的微觀示意圖
捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物
4.1鞭缭、在IP樣本管（Input管不加抗體和磁珠）中按照實驗的樣本內(nèi)分組設(shè)計分別對應(yīng)加入靶蛋白的一抗或者陰性對照Normal IgG，并在室溫下置于旋轉(zhuǎn)混勻儀中孵育 2 小時或者4度過夜魏颓×肜保抗體最佳用量需要通過預(yù)實驗來確定，一般來說甸饱，每管樣本中加入1-10 μg抗體沦童。
4.2、在孵育了靶蛋白一抗的Anti-target樣本管和孵育了陰性對照IgG的IgG樣本管中均加入ChIP級Protein A/G 磁珠叹话，每管中加入40μL的Protein A/G 磁珠偷遗，用于抓取抗體染色質(zhì)復(fù)合物，室溫孵育2小時驼壶。孵育時可以置于旋轉(zhuǎn)混勻儀中氏豌。
注意：
? ChIP級Protein A/G 磁珠已經(jīng)經(jīng)過了單鏈鮭魚精DNA的預(yù)包被處理，極大降低了實驗中非特異性吸附DNA作用帶來的假陽性热凹。
? 此磁珠是Protein A和Protein G的融合表達分子泵喘，將兩種分子的優(yōu)勢集于一身，可以對實驗中絕大部分種屬來源的抗體都有很高的親和力般妙，能強力捕獲常見的兔源抗體纪铺、小鼠源抗體、山羊源抗體股冗、綿羊源抗體霹陡、人源抗體及大鼠源抗體等。
? 此磁珠從4℃中取出，需要在室溫平衡30分鐘方可使用烹棉，不可高速離心攒霹，不可冷凍。并且需要在充分混勻重懸后立即快速吸出使用浆洗，以免磁珠沉降后吸出的懸液和理論量不符催束。
? 陰性對照Normal
IgG必須要和靶蛋白的一抗是同一種種屬來源，例如靶蛋白一抗是兔單抗伏社，那么Normal IgG應(yīng)該選擇Rabbit normal IgG抠刺，并且用量相同。
?
洗滌蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物
開始之前：
將ChIP Wash Buffer 1摘昌，ChIP Wash Buffer 2速妖，ChIP Wash Buffer 3，ChIP Wash Buffer 4全部置冰上預(yù)冷備用聪黎。?
4.3罕容、將上一步驟中的樣本管（IP組的管子，不包含Input管）置于磁力架中進行磁性分離稿饰，吸棄上清锦秒。
4.4、在每一管中加入0.5mL的ChIP Wash Buffer 1喉镰，重懸磁珠復(fù)合物旅择，置旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育5分鐘，磁性分離侣姆，吸棄上清生真。僅洗滌一次。
4.5捺宗、在每一管中加入0.5mL的ChIP Wash Buffer 2汇歹，重懸磁珠復(fù)合物，置旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育5分鐘偿凭，磁性分離，吸棄上清派歌。僅洗滌一次弯囊。
4.6、在每一管中加入0.5mL的ChIP Wash Buffer 3胶果，重懸磁珠復(fù)合物匾嘱，置旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育5分鐘，磁性分離早抠，吸棄上清霎烙。僅洗滌一次。
4.7、在每一管中加入0.5mL的ChIP Wash Buffer 4悬垃，重懸磁珠復(fù)合物游昼，置旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育5分鐘，磁性分離尝蠕，吸棄上清烘豌。僅洗滌一次。
溫馨提示：
如果在后續(xù)實驗中觀察到高背景(過多的非特異性結(jié)合)看彼，可以額外增加洗滌步驟的時間和次數(shù)廊佩。也可以在實施步驟Step 4.2 之前，不加一抗靖榕，直接用Protein A/G 磁珠孵育染色質(zhì)片段樣本 1 小時标锄，磁力分離，丟棄此磁珠茁计，只保留上清料皇，從而預(yù)先吸附、清除非特異性結(jié)合在磁珠上的染色質(zhì)片段簸淀。將上清液（經(jīng)過超聲或酶片段化處理的染色質(zhì)）轉(zhuǎn)移至一個新管中瓶蝴，然后按照前述步驟Step 4.2 對一抗和磁珠進行先后孵育。這種降低非特異性結(jié)合的方法叫做PRE-CLEAR租幕。
可以在最后一次的洗滌步驟中舷手，添加一個Western Blotting實驗，評估和驗證目的蛋白有無被成功捕獲劲绪，具體方法如下：在最后一次洗滌時男窟，取出40μL的磁珠復(fù)合物懸液，加入10μL的WB loading buffer上樣緩沖液贾富，煮沸10分鐘歉眷，磁力分離或離心分離，吸出上清颤枪，丟棄磁珠汗捡，將此上清拿去做WB實驗中的SDS-PAGE電泳跑膠，隨后進行WB實驗的正常轉(zhuǎn)膜畏纲、封閉扇住、一抗孵育、二抗孵育盗胀、曝光顯影的流程艘蹋，只是需要注意，雖然WB實驗檢測的是同一個靶蛋白票灰，但ChIP的一抗不一定適用于WB實驗女阀。因為ChIP一抗更傾向于結(jié)合天然構(gòu)象的靶蛋白宅荤，而WB實驗中的靶蛋白已經(jīng)被煮沸變性，WB一抗必須是識別靶蛋白線性表位浸策，而不是天然構(gòu)象冯键。這里這個WB驗證環(huán)節(jié)的目的是評估剛才的免疫沉淀IP實驗是否成功把靶蛋白捕獲沉淀下來。
洗脫并解交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物
開始之前
? 在此環(huán)節(jié)的榛，所有樣本管都要進行洗脫處理琼了，包括所有IP管。
? 如果是交聯(lián)過的樣本夫晌，則需要解交聯(lián)處理雕薪，包括所有Input管和IP管
? 將蛋白酶K從-20度中取出，置于室溫融化備用晓淀，同時將ChIP Elution Buffer從4度中取出恢復(fù)至室溫所袁，以便確保里面的SDS絮狀物溶解消失。
? 配制最終的即用型ChIP Elution Buffer：每個樣本管的用量為100μL 的ChIP Elution Buffer中加入1μL蛋白酶K凶掰，混合均勻備用燥爷。按照實驗中全部樣本管的總數(shù)量乘以上述的單個用量，計算整體用量懦窘，合并配制前翎。
4.8、將洗滌完成的每個IP管和Input管中加入100μL 新鮮配制的即用型ChIP Elution Buffer（已經(jīng)加了蛋白酶K）畅涂。
4.9港华、置于eppendorf的thermomixer?恒溫振蕩金屬浴（或等效儀器）上午衰，62℃孵育2個小時立宜，輕微振蕩。
4.10臊岸、隨后95℃再次孵育10分鐘橙数。結(jié)束后冷卻所有樣本管至室溫。
4.11帅戒、將所有樣本管放入磁力架中進行磁性分離灯帮，小心吸出上清，并轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管里逻住。
此時得到的上清就是本次染色質(zhì)免疫沉淀實驗洗脫得到的DNA片段施流，每管洗脫物約為100μL。
Step 5：回收DNA——genomic目的DNA片段純化
由于Step 4中洗脫得到的上清中除了DNA片段以外鄙信，還含有蛋白酶K，多種因酶切而生成的多肽忿晕、寡肽装诡、氨基酸等等“雜質(zhì)”，因此需要進行一次DNA片段的純化。
5.1鸦采、在裝有免疫沉淀洗脫物的所有樣本管內(nèi)每管加入600 μL苯酚：氯仿：異戊醇混合液（混合比例為25:24:1）宾巍，顛倒混勻10~15次后，室溫13000 g離心10分鐘渔伯，轉(zhuǎn)移上層水相到新離心管中顶霞。
5.2、每管加入25 μL的kit中ChIP專用鹽溶液锣吼、1 μL的kit中DNA沉淀增強物及1.2 mL無水乙醇选浑，-20℃沉淀樣品30分鐘2小時。
5.3玄叠、4℃古徒，16000 g離心30分鐘，棄上清读恃。
5.4隧膘、加入500 μL的80%乙醇（現(xiàn)用現(xiàn)配）洗滌沉淀，4℃寺惫，16000 g離心30分鐘疹吃，棄上清，室溫3-5分鐘自然干燥乙醇西雀。
注意：采用輕柔顛倒洗滌沉淀一次萨驶，吸頭不可以觸碰DNA沉淀，也不可過于干燥蒋搜，過于干燥會導(dǎo)致后續(xù)沉淀再次溶解十分困難篡撵。
5.5、加入50 μL無核酸酶H2O豆挽，溶解沉淀的DNA育谬。所得液體即為高純度的DNA片段。
5.6帮哈、富集后的DNA檢測膛檀，NanoDrop檢測Input組、IP組及IgG組產(chǎn)物DNA的濃度娘侍。同時也可以取5 μL樣本使用2%瓊脂糖凝膠120V恒壓電泳15分鐘咖刃，檢測DNA片段大小的分布狀態(tài)。
-20度憾筏，小心保存每管50 μL的DNA片段混合物
用于下游三大實驗（標準PCR嚎杨、熒光定量PCR、ChIP-sequence）
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