上一部分中介紹了最最基礎(chǔ)的PCR反應(yīng)和傳統(tǒng)分子克隆，包括內(nèi)切酶寄症，連接酶，外切酶矩动，PCR擴(kuò)增有巧，轉(zhuǎn)化等等是之后所有分子克隆的基礎(chǔ)。如果說限制性內(nèi)切酶克隆是入門級(jí)的話悲没，那平端克隆和TA克隆就是初級(jí)水平篮迎。
PCR克隆
PCR克隆是將目的基因經(jīng)過PCR擴(kuò)增后直接連接在載體上的克隆技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)分子克隆示姿，PCR克隆有著其獨(dú)特的優(yōu)勢甜橱，不需要特意尋找合適的酶切酶；不需要使得目的基因和載體之間兼容匹配栈戳；需要較少的DNA等岂傲。但是PCR克隆需要注意PCR 引物和擴(kuò)增條件、所選克隆方法和使用的克隆載體子檀。PCR最簡單的兩種克隆方式平末端克隆和TA克隆镊掖。
平末端克隆
? ? 將缺少突出端的插入片段連接到同樣沒有突出端線性載體中，使用具有 3’→5’ 核酸外切酶或具有校對(duì)活性的高保真 DNA 聚合酶能夠獲得平端插入片段(平滑端修飾)褂痰。它們的校正活性能夠提高擴(kuò)增產(chǎn)物的序列準(zhǔn)確性亩进；但是，最大的問題就是插入到平端克隆載體時(shí)的連接效率較低以及無法定向克隆缩歪。
TA克隆
TA克隆適用于可擴(kuò)增短DNA序列的熱穩(wěn)定TaqDNA聚合酶归薛。該酶缺乏 3’→5’ 校對(duì)活性，并具有可在擴(kuò)增子 3’ 末端（3’dA）額外添加脫氧腺嘌呤的末端轉(zhuǎn)移酶活性匪蝙。得到的具有 3′ dA 突出端的 PCR 產(chǎn)物連接到含有突出互補(bǔ) 3’ 脫氧胸腺嘧啶（3’dT）突出端的線性TA 克隆載體中主籍。dA的添加可用于常規(guī)PCR反應(yīng)添加，也可以是平末端添加dA骗污，取決于你的目的片段和所采用的試盒崇猫。比如Takara的Mighty TA-cloning Kit 中是在3'端獲得一個(gè)dA堿基；Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?中DNA聚合酶具有很強(qiáng)的3'-5'外切酶活性需忿，會(huì)導(dǎo)致平末端需要去額外添加A堿基诅炉。
優(yōu)點(diǎn)：不需要引物和特定的酶切位點(diǎn)序列蜡歹，簡單方便；
缺點(diǎn)：加大酶切位置的判斷難度涕烧，過長的片段會(huì)導(dǎo)致克隆效率的降低月而。
TA克隆和平末端克隆
TA克隆 常見T載體
? ? 二十年前，TOPO 之名就已成為 PCR 克隆領(lǐng)域高質(zhì)量和顛覆性創(chuàng)新的代名詞议纯。如今父款，TOPO 克隆試劑盒仍然是最快捷、最簡單瞻凤、最高效的克隆解決方案憨攒。TOPO克隆技術(shù)就是很好的將上述所講技術(shù)的結(jié)合。如下圖所示阀参，TOPO流程更加的方便肝集，快捷，高效蛛壳。
? ? TOPO克隆載體的核心在于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I杏瞻，該酶同時(shí)具有限制酶和連接酶特性，拓?fù)洚悩?gòu)酶I可特異性地識(shí)別五核苷酸序列5’-(C/T)CCTT-3’衙荐，并且可與連接到3′胸腺嘧啶脫氧核苷的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)鍵捞挥。TOPO克隆類型根據(jù)PCR產(chǎn)物和相對(duì)應(yīng)的克隆載體末端有密切關(guān)系。主要分為TOPO TA Cloning忧吟；利用Zero Blunt TOPO克隆方法克隆平末端DNA砌函；利用定向TOPO克隆方法克隆平末端DNA。
TOPO克隆流程
隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和對(duì)效率的需求越來越旺盛瀑罗，無縫克隆逐漸走進(jìn)了大家的視野胸嘴，相比之下雏掠，無縫克隆操作更加簡單斩祭，靈活性更強(qiáng)，同時(shí)幾乎不受序列的限制乡话，一次可定向組裝高達(dá)10個(gè)片段的dsDNA摧玫。接下來就是我們的重點(diǎn)：無縫克隆。
? ? 無縫克隆相比較之前所講的限制性內(nèi)切酶克隆和PCR克隆绑青，其不會(huì)在年末端或者平末端形成一道"裂縫"诬像，所以稱之為無縫克隆。在這一部分闸婴，我們主要講一下無縫克隆基礎(chǔ)以及所分的流派和現(xiàn)在市面上有的產(chǎn)品坏挠；所依賴的簡單原理，為后面的應(yīng)用提供一個(gè)基礎(chǔ)邪乍。
無縫克隆分類
? ? 現(xiàn)在主流的兩種無縫克隆是Gibson assembly和Golden Gate assembly降狠。因?yàn)镚ibson assembly廠商多对竣，方法流程化榜配，應(yīng)用廣泛所以現(xiàn)在主講Gibson assembly，如果有后續(xù)需要蛋褥，再學(xué)習(xí)Gate。與傳統(tǒng)的雙酶切克隆一般烙心，無縫克隆同樣需要目的片段的插入并依賴于dsDNA的黏性末端進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)膜廊，并利用DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵修復(fù)缺口。它本質(zhì)上和之前介紹的PCR克隆是一樣的淫茵，但是需要目的片段連接端通過PCR方法連接15-20bp載體連接位點(diǎn)的同源序列，然后將DNA片段和載體混合并加入Master Mix進(jìn)行連接痘昌，從而完成“無縫”克隆。
無縫克隆大致流程
*綜上我們發(fā)現(xiàn)最重要的部分就是Master Mix
一種外切酶辆苔，而不是之前的內(nèi)切酶算灸。從5’端開始對(duì)DNA進(jìn)行消化，產(chǎn)生長的黏性末端驻啤，這樣才能與另外的同源末端進(jìn)行配對(duì)結(jié)合菲驴。因?yàn)槭菑?'端開始切除堿基骑冗，所以引物設(shè)計(jì)就非常關(guān)鍵了。特異性引物設(shè)計(jì)部分還是遵循著上一部分所講的原則贼涩，而同源序列的設(shè)計(jì)可以按照下圖所示原則進(jìn)行設(shè)計(jì)。
同源序列引物設(shè)計(jì)
聚合酶負(fù)責(zé)堿基連接谤绳；連接酶負(fù)責(zé)DNA片段的連接袒哥。有意思的是，5'外切酶最適合溫度是37℃堡称，連接酶和聚合酶反應(yīng)溫度為50℃，三個(gè)酶在一個(gè)體系內(nèi)却紧，溫度的控制使得DNA不會(huì)被剪切為ssDNA钞艇，同源序列引物序列>15bp豪硅，使得反應(yīng)順利進(jìn)行。
Gibson Assembly最大的優(yōu)勢就是能夠不受片段序列的限制飘弧、實(shí)現(xiàn)任意組裝砚著。因?yàn)槭强客粗亟M進(jìn)行連接次伶，所以沒有必要去考慮限制性內(nèi)切酶是否會(huì)切斷目的片段稽穆；同時(shí)無縫地拼接多個(gè)片段，傳統(tǒng)的酶切克隆柱彻，由于酶切位點(diǎn)有限能組裝的片段數(shù)量是有限的。同時(shí)哟楷，由于酶切位點(diǎn)之間存在著一定的空間距離否灾，片段與片段之間不可避免地會(huì)產(chǎn)生間隔；能夠節(jié)省時(shí)間墨技。
? ? 這部分我們簡單介紹了PCR克隆基礎(chǔ)技術(shù)和無縫克隆的基礎(chǔ)原理，分類以及優(yōu)勢断楷。后面將具體介紹無縫克隆的流程私痹，引物設(shè)計(jì)工具以及Snapgene的應(yīng)用方式。
