琥珀酰亞胺酯(SE或NHS)已被證明是最好的氨基修飾試劑肋乍，因?yàn)樗c氨基形成的酰胺鍵與天然蛋白中的酰胺鍵一模一樣。Dye-SE與脂肪胺具有很高的反應(yīng)活性敷存。Dye-SE與生物分子連接須考慮以下因素的影響悔详。
1. 溶劑:大多數(shù)情況下瘪贱，應(yīng)該溶解在無水DMF或DMSO中驼仪，特別是對(duì)非水溶性染料艘儒。
2. 反應(yīng) pH:Dye-SE與非質(zhì)子化的脂肪胺的反應(yīng)受pH影響較大，一般反應(yīng) pH>7.5涮俄。蛋白的修飾經(jīng)常在pH 7.5～8.5進(jìn)行蛉拙。
3. 反應(yīng)緩沖溶液:不能使用含有自由氨基的緩沖溶液。銨鹽(例如硫酸銨和醋酸銨等常用的蛋白沉淀劑例如runngngrongye)在標(biāo)記前也必須除去彻亲。
4. 反應(yīng)溫度:一般在常溫或4℃進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)刘离。
以下標(biāo)記步驟僅供參考睹栖，客戶可根據(jù)自己的情況進(jìn)行優(yōu)化硫惕。
Dyes-SE標(biāo)記蛋白
1. 將 1 mg NHS-ester Dyes 溶解在 50 μL無水并且不含氨基的 DMF中 (最終濃度大約25 nmol·μL-1)得到工作液。
2. 將標(biāo)記的蛋白溶解在碳酸氫鈉緩沖液中(pH 9.0, 50 mM)野来。
3. 將一定量的 NHS-ester Dyes 工作液滴定到蛋白的緩沖溶液中常溫反應(yīng)1小時(shí)以上恼除。因?yàn)镹HS-ester Dyes反應(yīng)活性很高，2倍蛋白摩爾量的NHS-ester Dyes 得到的F/P=1～2曼氛。過量標(biāo)記會(huì)影響蛋白活性并降低量子產(chǎn)率豁辉。
4. 用Sephadex column (Sephadex G25 medium; eluent PBS pH 7.2, 22 mM)分離標(biāo)記蛋白，通常第一個(gè)流出色帶就是標(biāo)記蛋白舀患。
Dyes-SE標(biāo)記抗體
1. 帶標(biāo)記的抗體應(yīng)該先經(jīng)過Protein A- 或 Protein G-Sepharose柱子純化徽级，抗體濃度至少1 mg/mL，體積在0.5～2 mls聊浅。
2. 標(biāo)記前先將抗體在0.1 M sodium bicarbonate buffer pH 8.5 透析4小時(shí)餐抢。
3. 將Dye-NHS ester溶解在無水DMSO 濃度1 mg/mL。Dye-NHS ester易水解低匙，其溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配旷痕，DMSO中可加入少量分子篩除水。
4. 將抗體從透析液中轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf 管中顽冶，輕輕搖動(dòng)欺抗，每毫升抗體中緩慢加入125 μL NHS ester工作液，室溫反應(yīng)4小時(shí)强重。(這時(shí)抗體和Dye-NHS ester重量比是8:1 w/w绞呈。客戶可根據(jù)自己的條件间景，按此在4:1～10:1之間調(diào)整最佳比例佃声。)
5. 將反應(yīng)液在1000倍的PBS pH 7.4 緩沖液中4℃透析以除去未反應(yīng)的Dye，必要時(shí)過柱子純化拱燃，一般第一個(gè)流出色帶就是標(biāo)記抗體秉溉。
