這篇文主要參考 Tn5 as a model for understanding DNA transposition乃正，來了解Tn5的轉(zhuǎn)座機制送膳。

轉(zhuǎn)座概念

參與分子

轉(zhuǎn)座過程

轉(zhuǎn)座 (transposition)

可移動的DNA片段即可移動因子 (Transposable elements) 在基因組上自由轉(zhuǎn)移稱為轉(zhuǎn)座龙宏，DNA與所插入的基因位點可以是非同源的揉阎。轉(zhuǎn)座是產(chǎn)生基因多樣性的重要機制具滴，可移動因子可產(chǎn)生插入 (insertion)晓勇，缺失 (deletion)，倒置 (inversion) 以及染色體融合突變 (chromosomal fusion mutations)昼接。[1]

轉(zhuǎn)座需要通過轉(zhuǎn)座酶的催化完成爽篷。根據(jù) 1）轉(zhuǎn)座酶與DNA是否形成共軛中間體和 2）蛋白質(zhì)活性殘基可以將轉(zhuǎn)座酶分為5類： tyrosine (Y), serine (S), relaxase (Y1) and rolling-circle (Y2) , 這4類是轉(zhuǎn)座酶與DNA形成共軛中間體；而第5類稱為DDE轉(zhuǎn)座酶慢睡，是通過酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)完成的逐工。[2]

DDE轉(zhuǎn)座酶的催化中心是由三個分離的區(qū)域N2，N3和C1漂辐，分別含有天冬氨酸 (D)泪喊，天冬氨酸 (D) 和 1個谷氨酸 (E) 組成，雖然三個區(qū)域間有不同長度間隔區(qū)者吁，但通過蛋白質(zhì)折疊形成三聯(lián)體參與催化窘俺。

原核生物的轉(zhuǎn)座分為兩種方式，復(fù)制轉(zhuǎn)座和保守轉(zhuǎn)座。復(fù)制轉(zhuǎn)座的供體DNA完整瘤泪，把通過復(fù)制的DNA片段插入基因位點上灶泵；保守轉(zhuǎn)座則是從供體DNA上分離一段DNA，以轉(zhuǎn)座酶作為中介对途，連接到目標DNA上而實現(xiàn)的 (又被成為 'cut and paste' 轉(zhuǎn)座)赦邻。

Tn5是極好的模型來研究保守轉(zhuǎn)座模式。

參與Tn5轉(zhuǎn)座的三個大分子

轉(zhuǎn)座子 (Transposon) ：可移動DNA片段实檀。
轉(zhuǎn)座酶 (Transposase /Tnp) ：催化轉(zhuǎn)座的蛋白質(zhì)惶洲；野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶是一種活性極低的蛋白質(zhì)。
目標DNA (Target DNA)：可以與轉(zhuǎn)座子在同一個DNA分子上膳犹，甚至在轉(zhuǎn)座子內(nèi)恬吕；或在另一個DNA分子上。

1. 轉(zhuǎn)座子

簡化的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)：
包含合成Tnp的DNA序列须床，兩個19bp 長的末端以及任意DNA序列铐料。如圖：

simplified transposon

末端是兩個19bp 長的片段，將Tnp和任意DNA序列包含在其中豺旬。有三種常見的末端：外端 (outside end /OE) 钠惩，內(nèi)端 (inside end /IE) 和鑲嵌性尾端 (mosaic end /ME)。組合方式有兩個反向的 OE族阅，或者兩個反向的 IE篓跛，或者兩個反向的 ME，又或者是兩組反向的 OE 和 IE 組合坦刀。
如下圖所示愧沟， OE 與 IE 有7個位點的不同，但在 IE 沒有Dam-DNA甲基化的情況下求泰，兩類末端都可被 Tnp 識別央渣。而 ME 混合了這7個不同的位點计盒，是一種比OE與IE活性更高的序列渴频。

End sequences
位于兩個末端中間的DNA序列只需要滿足長度足夠即可。該長度要能保證 Tnp 在與兩個末端結(jié)合后北启，Tnp 可以相互結(jié)合形成復(fù)合物卜朗。

Tn5 的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)：
Tn5 轉(zhuǎn)座子是由兩個反向的插入片段 IS50以及兩組OE 和 IE 構(gòu)成。

IS50 包括三個抗生素抗性基因咕村。IS50R負責(zé)編碼Tnp和轉(zhuǎn)座抑制物 (Inh), 而IS50L負責(zé)編碼兩個低活性蛋白场钉。

Tn5

IS (insertion sequence): 插入序列，很行柑巍（< 2.5 kb）DNA片段逛万，可以在不同的基因位點跳躍，或自我復(fù)制批钠。通常存在于細菌與古細菌基因中宇植，但也可存在于真核生物的轉(zhuǎn)座元素中得封。編碼的基因一般只與移動有關(guān)。 [2]

2. 轉(zhuǎn)座酶

Tn5 Tnp 有476個氨基酸長指郁；屬于IS4轉(zhuǎn)座酶家族忙上，其擁有YREK motif。
主要功能區(qū)：尾端DNA結(jié)合決定簇闲坎、二聚體結(jié)合域和活性位點疫粥。

野生型 Tnp的主要特性是極不活躍。在體外沒有活性腰懂，而體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座的概率僅為1/10^5細胞梗逮。通過四種類型的突變可使活性提升至少4個數(shù)量級：

1. 分離N端與 C端
以L372P為例，N端（含DNA結(jié)合域）與 C端（含二聚化結(jié)合域）相互抑制活性绣溜，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因極有可能是兩者之間距離太近库糠。因此可以通過改變構(gòu)象將兩個結(jié)合域分離，從而提高活性涮毫。L372P是通過引入脯氨酸到靠近C端的α螺旋里瞬欧，使得螺旋斷裂，從而將C端拖離N端罢防。

2. 提高Tnp與轉(zhuǎn)座子末端的結(jié)合
以E54K為例艘虎，E54K提高了Tnp 與OE DNA的結(jié)合，而靠近 54殘基的突變也可達到相似的提高效果咒吐。由此可見野建， DNA結(jié)合域的結(jié)構(gòu)不是與OE 的結(jié)合的最優(yōu)形態(tài)。其他研究表明恬叹，與IE 的結(jié)合也有相似的結(jié)論候生。

3. 形成直接的E-K相互作用，形成特定結(jié)構(gòu)并與轉(zhuǎn)座子末端的結(jié)合
E110 和 E345 殘基通過形成 Mn++/Mg++鹽橋绽昼。圍繞在E345周圍的殘基（342唯鸭，344 和348）能與末端DNA相結(jié)合，說明110 和 345 殘基形成的結(jié)構(gòu)能夠精準安排這個區(qū)域的殘基與末端DNA結(jié)合硅确。E110K或E345K的突變使得 110與345之間形成直接的E-K相互作用目溉，由此削弱了鹽橋的必要性。E-K相互作用可能改善了345區(qū)域結(jié)構(gòu)而與末端DNA結(jié)合更易結(jié)合菱农，或者在野生型Tnp中缭付，沒有足夠的Mg++形成這個結(jié)構(gòu)。

4. 提升形成 β-loop clamp的靈活性
242殘基由P變?yōu)锳/G將極大提高活性循未。這個突變提高了242-247在末端DNA上形成 β-loop clamp的靈活性陷猫。242的脯氨酸（P）是這的loop的基礎(chǔ)，相較于丙氨酸（A）和甘氨酸（G），脯氨酸作為支柱更加牢固绣檬。

野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶是一種活性極低的蛋白質(zhì)舅巷。這是因為要在宿主的生存和轉(zhuǎn)座之間保持平衡。過多的轉(zhuǎn)座將會導(dǎo)致基因功能的丟失河咽。

YREK motif: 是 IS4 家族的主要標志之一钠右。Y-(2)-R-(3)-E-(6)-K 位于 C1區(qū)域（DDE motif 谷氨酸 (E) 所在區(qū)域）。
DDE motif: D(60~110) D (100~150)E忘蟹。

在IS4家族中的DDE和YREK motif

Tn5轉(zhuǎn)座過程

組裝過程是二聚體化的飒房，雙鏈DNA與轉(zhuǎn)座酶的兩個蛋白質(zhì)亞基結(jié)合，引導(dǎo)轉(zhuǎn)座子末端進入活性位點媚值。[3]
酶與轉(zhuǎn)座子結(jié)合→DNA切割 →目標捕獲和鏈轉(zhuǎn)移→分離與修復(fù)

Steps in Tn5 transposition

1. 結(jié)合
由于沒有明確的證據(jù)狠毯，結(jié)合過程可以 1）如圖中所示，兩個單分子Tnp分別與末端DNA結(jié)合褥芒，然后兩個單分子再形成二聚體嚼松；2）亦或者是二聚體Tnp先與一端末端結(jié)合，再與另一末端結(jié)合锰扶；3）又或者是兩種情況同時發(fā)生献酗。

結(jié)合的第一步必須包括Tnp的C端與N端分離；
隨后Tnp與末端DNA結(jié)合：Tnp的 26-65 的殘基與DNA 6-17 號位結(jié)合坷牛，大部分的結(jié)合位 '順式' 罕偎，并且這個順式結(jié)合有可包括342，344 和348殘基京闰；
接下來Tnp與末端DNA形成二聚化復(fù)合物：2個Tnp C端的α螺旋交叉而形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合颜及。末端DNA 1-9 號位插入搭檔單體Tnp的活性位點形成 '反式' Tnp-DNA結(jié)合，并靠近DDE區(qū)域蹂楣。反式DNA結(jié)合十分重要俏站，由于接下來所有的催化步驟都是反式的。

2. DNA切割
該階段包括三個催化步驟：3'鏈斷裂痊土，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的斷裂肄扎。
Tnp的活性位點DDE殘基配位兩個Mg++，這兩個Mg++作為親核試劑激活氧原子施戴，使氧原子切斷P-O鍵。

首先赞哗，來自水分子的氧原子作為親核試劑使兩個末端轉(zhuǎn)移鏈（transferred strand）的3'端斷裂。
第二步肪笋，來自3'轉(zhuǎn)移鏈的3'OH基團攻擊非轉(zhuǎn)移鏈（non-transferred strand）的5'端形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。發(fā)卡結(jié)構(gòu)使得轉(zhuǎn)座子DNA從供體DNA中脫離藤乙。
5'非轉(zhuǎn)移鏈發(fā)生了一些移動猜揪，使得發(fā)卡結(jié)構(gòu)的斷裂，并為目標DNA的接入騰出空間坛梁。

3. 目標捕獲和鏈轉(zhuǎn)移
在目標DNA捕獲階段而姐，有一些序列產(chǎn)生偏移划咐。由于兩個3'OH基團相距41 ?，要稍遠與所攻擊的目標DNA兩個磷酸二酯鍵之間9bp的距離褐缠。故這兩個3'OH基團被鑲嵌在一個可以容納DNA的裂縫中政鼠，并且這個裂縫含有許多活性殘基。DNA被捕捉到這個裂縫等待鏈的轉(zhuǎn)移队魏。
等DNA被捕捉后公般，兩個3'OH基團攻擊位于目標DNA上相距9bp的磷酸二酯鍵，完成轉(zhuǎn)座子DNA到目標DNA的轉(zhuǎn)移官帘。在體外時昧谊，鏈轉(zhuǎn)移的兩個末端并不同時發(fā)生遏佣。

4. 分離與修復(fù)
體外與體內(nèi)轉(zhuǎn)座的重大區(qū)別體現(xiàn)在鏈與轉(zhuǎn)座復(fù)合物的分離揽浙。
在分離后會有兩個9bp的缺口在兩個末端。

目標DNA最后產(chǎn)生9bp的重復(fù)在ATAC-seq后續(xù)分析里要處理馅巷。這個長度近似于一個完整的DNA螺旋。

References:
[1] Reznikoff W S. Tn5 as a model for understanding DNA transposition[J]. Molecular microbiology, 2003, 47(5): 1199-1206.
[2] De Palmenaer D, Siguier P, Mahillon J. IS 4 family goes genomic[J]. BMC evolutionary biology, 2008, 8(1): 18.
[3] Davies D R, Goryshin I Y, Reznikoff W S, et al. Three-dimensional structure of the Tn5 synaptic complex transposition intermediate[J]. Science, 2000, 289(5476): 77-85.