2021年07月02日，Nature communications在線發(fā)表了復(fù)旦大學(xué)（中山醫(yī)院）肝癌研究所樊嘉院士、楊欣榮教授團(tuán)隊與深圳華大生命科學(xué)研究院合作的最新成果Dissecting spatial heterogeneity and the immuneevasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma暑认。論文通過單細(xì)胞測序解析肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的時空異質(zhì)性和免疫逃逸新機(jī)制。
此項研究的測序數(shù)據(jù)已存儲于國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺（CNGBdb）列吼，項目編號為：CNP0000095沪编。?
研究背景
腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程坎匿，眾多學(xué)者認(rèn)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell盾剩，CTC）作為腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的“種子”細(xì)胞，在這一過程中扮演極其重要的角色替蔬。CTC 定義為源自腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶告私、存在于血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，在正常人體內(nèi)幾乎不存在承桥。CTC在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的播散過程是一個時間和空間上的動態(tài)過程驻粟。這樣推測CTC在其轉(zhuǎn)移路徑上存在著表型和分子上的差別（即時空異質(zhì)性）。因此凶异，僅針對外周血CTC的研究可能只是管中窺豹蜀撑，露出的僅僅是在特定時間挤巡、特定部位CTC 的冰山一角，并不能全面反映CTC的時空特征屯掖。
研究內(nèi)容
為了全面剖析CTC在整個循環(huán)播散時空過程中的特征變化及其背后的分子機(jī)制玄柏，作者決定對體內(nèi)不同血管部位的CTC進(jìn)行單細(xì)胞層面的深入研究襟衰。肝癌細(xì)胞從肝內(nèi)原發(fā)灶脫落首先會經(jīng)過肝靜脈（hepatic vein, HV）釋放進(jìn)入下腔靜脈贴铜，然后隨血流進(jìn)入心臟，再通過肺循環(huán)以后瀑晒，CTC進(jìn)入外周動脈（Peripheral artery, PA）绍坝，經(jīng)過外周毛細(xì)血管網(wǎng)衅金，CTC流入外周靜脈（Peripheral vein, PV）粟誓，門靜脈（Portal vein, PoV）則收集來自消化系統(tǒng)的靜脈血再次流入肝臟。本研究共入組10例原發(fā)性肝癌行根治性切除手術(shù)的病人侠讯，在切除腫瘤之前玖详，采集CTC從原發(fā)灶播散開始沿著循環(huán)路徑上的這四個關(guān)鍵血管部位的血液把介，即肝靜脈（HV）、外周動脈（PA）蟋座、外周靜脈（PV）和門靜脈（PoV）拗踢。將CTC陰性富集后，再通過單細(xì)胞操控機(jī)器人把單個未固定的CTC挑選出來向臀，共成功分離295個CTC單細(xì)胞巢墅，進(jìn)行單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序，完成轉(zhuǎn)錄組測序后（scRNA-seq）共獲得113個質(zhì)控合格的CTC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行下游生物信息分析（圖1）券膀。
首先君纫，通過與配對原發(fā)腫瘤表達(dá)譜結(jié)果進(jìn)行比對，分析發(fā)現(xiàn)CTC表達(dá)上調(diào)的基因涉及細(xì)胞遷移侵襲和免疫應(yīng)答芹彬、細(xì)胞周期蓄髓、細(xì)胞凋亡等信號通路。針對不同血管部位內(nèi)的CTC異質(zhì)性分析舒帮，首次觀察到HV CTC的異質(zhì)性最高会喝，流入外周動脈以后CTC異質(zhì)性顯著降低，在外周靜脈和門靜脈內(nèi)CTC的異質(zhì)性再次升高会前。這一結(jié)果提示：① CTC是由原發(fā)灶不同克隆所釋放的腫瘤細(xì)胞所構(gòu)成好乐，因此在肝臟流出道HV內(nèi)的CTC存在很高的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性；② 在肺循環(huán)的毛細(xì)血管網(wǎng)濾過和動脈系統(tǒng)高剪切力的影響下瓦宜，可能只有個頭較小蔚万、細(xì)胞變形能力強(qiáng)以及抵抗流體剪切力強(qiáng)的CTC能生存下來，因而在PA中的CTC已經(jīng)過篩選临庇，異質(zhì)性顯著降低反璃；③ 在外周靜脈和門靜脈內(nèi)檢測到的CTC由于在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)“游蕩”了很久昵慌，受循環(huán)中各種理化因素和生物因素的影響，如血流剪切力淮蜈、失巢凋亡斋攀、低氧狀態(tài)、細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞等梧田，CTC為了適應(yīng)這些外在壓力可能會主動激活不同的信號通路淳蔼。因此，CTC在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平表現(xiàn)為異質(zhì)性也逐漸增加裁眯。
隨后團(tuán)隊分別對相鄰兩個關(guān)鍵血管部位的CTC 表達(dá)譜進(jìn)行差異基因分析鹉梨，發(fā)現(xiàn)不同循環(huán)部位之間的 CTC 呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄組的時空動態(tài)變化特征。從 HV 到 PA 的過程中穿稳，CTC 的整體轉(zhuǎn)錄活性降低存皂；從 PA 到 PV 的過程中，CTC 的轉(zhuǎn)錄活性又逐漸增加逢艘。從 HV 到 PA 階段旦袋，下調(diào)的基因富集在細(xì)胞生長和增殖等信號通路，包括 Myc 靶基因它改、G2/M 檢查點(diǎn)相關(guān)基因疤孕、mTORC1 通路基因等；而上調(diào)的基因主要涉及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）搔课、趨化因子胰柑、血小板激活等信號通路，這些信號通路的活化將賦予CTC抵抗免疫系統(tǒng)識別和攻擊的能力爬泥，對于CTC的成功定植具有關(guān)鍵意義柬讨。當(dāng) CTC 從PA行至 PV 區(qū)域， Myc 靶基因的表達(dá)又開始上升袍啡，由于缺氧和 ROS 影響踩官，糖酵解和氧化應(yīng)激的通路開始激活。上述結(jié)果首次從單細(xì)胞水平揭示CTC可以通過主動調(diào)控其轉(zhuǎn)錄組活化或關(guān)閉相關(guān)信號通路來適應(yīng)循環(huán)過程中所面臨的各種環(huán)境壓力境输，以達(dá)到“適者生存”進(jìn)而成功實(shí)施轉(zhuǎn)移的終極目標(biāo)蔗牡。
在CTC循環(huán)過程中所面臨的各種環(huán)境壓力中，免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是抑制 CTC 體內(nèi)生存的關(guān)鍵“守門人”嗅剖。原發(fā)腫瘤內(nèi)存在大量浸潤的免疫抑制細(xì)胞辩越，如調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（regulatory T cell, Treg）、骨髓來源的抑制性細(xì)胞信粮、中性粒細(xì)胞黔攒、巨噬細(xì)胞等，可抑制局部抗腫瘤免疫細(xì)胞的殺傷功能，如自然殺傷細(xì)胞和CD8+ T 細(xì)胞等督惰，形成有利于腫瘤細(xì)胞生存和發(fā)展的免疫抑制微環(huán)境不傅。當(dāng)腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)灶進(jìn)入血液循環(huán)后，腫瘤細(xì)胞便直接暴露在功能正常的免疫系統(tǒng)監(jiān)視之下赏胚。與原發(fā)灶的免疫抑制微環(huán)境相比访娶，血液循環(huán)內(nèi) NK 和 CD8+ T 細(xì)胞抗腫瘤功能處于激活狀態(tài)，可有效識別和殺傷進(jìn)入循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞觉阅。因此崖疤，CTC如何逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊是其成功實(shí)施轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)鍵“限速步驟”。
為了探尋肝癌CTC免疫逃逸的關(guān)鍵基因留拾，團(tuán)隊首先分析了腫瘤免疫逃逸相關(guān)基因和所有細(xì)胞因子基因在CTC和肝癌原發(fā)灶之間的差異表達(dá)戳晌，結(jié)果顯示細(xì)胞因子CCL5變化幅度在CTC上調(diào)基因中位列第一，并且CTC從HV至PA痴柔、PV和PoV的過程中CCL5表達(dá)呈持續(xù)上調(diào)狀態(tài)，結(jié)合既往研究中證實(shí)的CCL5具有招募Treg進(jìn)而抑制抗腫瘤免疫的作用疫向，推測CCL5可能是肝癌CTC實(shí)施免疫逃逸的關(guān)鍵基因咳蔚；針對癌旁肝組織微血管內(nèi)的CTC進(jìn)行多色免疫熒光分析也證實(shí)了CCL5+ CTC的存在，以及它們與CCR5+ Treg的空間相鄰關(guān)系搔驼，進(jìn)而通過獨(dú)立臨床隊列證實(shí)外周血CCL5+ CTC與CCR5+ Treg呈正相關(guān)谈火；作者還對兩個已發(fā)表的肝癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，結(jié)果也證實(shí) CCL5 表達(dá)與肝癌瘤內(nèi)和門靜癌栓（PVTT）中的 FOXP3（Treg標(biāo)志物）表達(dá)呈正相關(guān)舌涨；進(jìn)一步探索了CCL5+CTC 與循環(huán)Treg之間平衡的臨床相關(guān)性糯耍，結(jié)果表明Treghigh / CCL5+ CTChigh 肝癌病人術(shù)后預(yù)后最差。因此囊嘉，作者推測CTC可能通過分泌CCL5來招募Treg實(shí)現(xiàn)對殺傷細(xì)胞的免疫抑制温技，進(jìn)而逃避免疫殺傷，促進(jìn)CTC播散和轉(zhuǎn)移扭粱。隨后系統(tǒng)的體舵鳞、內(nèi)外實(shí)驗表明高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系（MHCC97H）中 CCL5 蛋白表達(dá)水平顯著高于低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系（HepG2，Huh7 和 MHCC97L）琢蛤，同時MHCC97H上清招募 Treg的能力也顯著強(qiáng)于Huh7上清蜓堕，并且這種遷移活性可被CCL5中和抗體所抑制；小鼠轉(zhuǎn)移模型也證實(shí)博其，CCL5敲減后Hepa1-6在體內(nèi)清除速度較對照細(xì)胞顯著增快套才，同時Treg 耗竭的小鼠清除Hepa1-6的能力也較對照小鼠更強(qiáng)，作者還發(fā)現(xiàn)CCL5敲減后Hepa1-6的肺轉(zhuǎn)移能力顯著降低慕淡；小鼠轉(zhuǎn)移模型還證實(shí)敲減Hepa1-6的CCL5表達(dá)可以抑制Treg 募集背伴，同時還可促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移瘤中活化CD8+ T細(xì)胞的浸潤。體內(nèi)和體外模型結(jié)果表明：CTC可通過主動分泌CCL5來募集Tregs，從而抑制殺傷性CD8+ T細(xì)胞的功能挂据，在轉(zhuǎn)移定植過程中建立有利于其生存的局部微環(huán)境以清。
最后，團(tuán)隊探索了調(diào)控CTC CCL5表達(dá)的分子機(jī)制崎逃。為鑒定誘導(dǎo)CCL5表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子掷倔，我們分析了CTC內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)與 CCL5表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示正相關(guān)程度最高的轉(zhuǎn)錄因子是MYC-associated factor X（MAX）个绍。GeneHancer預(yù)測結(jié)果提示MAX是能夠與 CCL5 基因增強(qiáng)子結(jié)合的 TF之一勒葱；對CTC上調(diào)的基因集進(jìn)行KEGG分析后發(fā)現(xiàn)p38 MAPK通路顯著富集；同時巴柿，p38 MAPK信號通路中的多個關(guān)鍵基因凛虽，包括TAOK1，TAOK2广恢，MAP2K3凯旋，PLA2G4A和 MAX 在CTC中均顯著上調(diào)，提示CTC中的p38 MAPK通路呈激活狀態(tài)钉迷；進(jìn)一步的體內(nèi)至非、外實(shí)驗證實(shí)p38-MAX通路是調(diào)控CTC CCL5表達(dá)的關(guān)鍵信號通路，抑制p38-MAX通路可顯著降低CTC的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移能力糠聪。
研究意義
綜上所述荒椭，本項發(fā)表在Nature Communications的研究，首次從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組層面證實(shí)了CTC在體內(nèi)循環(huán)過程中的時空異質(zhì)性舰蟆；系統(tǒng)揭示了CTC動態(tài)調(diào)控相關(guān)信號通路以適應(yīng)循環(huán)過程中所面臨的各種環(huán)境壓力趣惠；闡明了CTC通過活化p38-MAX信號通路誘導(dǎo)CCL5表達(dá)，進(jìn)而招募Treg實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的相關(guān)分子機(jī)制（圖2）身害。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索靶向CTC的抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移策略提供了新思路味悄。
復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士、楊欣榮主任醫(yī)師题造、深圳華大生命科學(xué)研究院侯勇研究員為本文共同通訊作者傍菇，孫云帆主治醫(yī)師、吳靚博士界赔、劉石平研究員丢习、江苗苗博士、胡博主治醫(yī)師為本文共同第一作者淮悼。? ??
首發(fā)公號：國家基因庫大數(shù)據(jù)平臺??
參考文獻(xiàn)
Sun, YF., Wu, L., Liu, SP.?et al.?Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma.?Nat Commun?12,?4091 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-24386-0
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