小編今天給大家?guī)?lái)一篇2012年cell雜志發(fā)表的 關(guān)于m6A在mRNA上富集的綜合分析文獻(xiàn)解讀和文獻(xiàn)中研究方法的介紹翻具。

Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and Near Stop Codons

文獻(xiàn)摘要：m6A在RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾中是普遍存在的神帅，而之前發(fā)現(xiàn)的肥胖疾病相關(guān)的基因FTO基因能編碼一種m6A去甲基酶影響m6A绝骚，是生理學(xué)進(jìn)程中重要的調(diào)控作用砰左。本文介紹的是一種在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)分析m6A分布的方法：MeRIP-Seq箭券。作者用這種方法鑒定出來(lái)7,676個(gè)哺乳動(dòng)物的包含m6A的mRNA基因允华，表明了m6A是mRNA共有的分子堿基修飾作用井联，同時(shí)m6A表現(xiàn)出來(lái)很強(qiáng)組織特異性調(diào)節(jié)并且在大腦發(fā)育過(guò)程中明顯增加卜壕。作者發(fā)現(xiàn)m6A在mRNA的3’-UTR區(qū)和終止密碼子附近含量豐富，并且m6A的富集區(qū)域與3’-UTR的microRNA結(jié)合區(qū)相關(guān)聯(lián)烙常。這些發(fā)現(xiàn)揭示了一種哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組表觀調(diào)控的觀點(diǎn)轴捎。

1鹤盒、哺乳動(dòng)物mRNA的m6A檢測(cè)

作者首先通過(guò)dot blot的方法驗(yàn)證m6A抗體是否能與RNA上的m6A產(chǎn)生免疫反應(yīng)，先分別將m6A修飾的寡聚核苷酸和非修飾的寡聚核苷酸點(diǎn)在尼龍膜上侦副，然后用m6A抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)侦锯，再將m6A修飾的寡聚核苷酸點(diǎn)在膜上，用于免疫反應(yīng)的m6A抗體分別用不同濃度的修飾RNA和非修飾的RNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后與膜上的m6A修飾的RNA進(jìn)行免疫反應(yīng)秦驯，說(shuō)明該m6A抗體只和m6A修飾的RNA產(chǎn)生免疫反應(yīng)尺碰。

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圖注：A是不同濃度的M6A修飾和未修飾的RNA與m6A抗體的免疫反應(yīng)，B是用M6A修飾的RNA和未修飾的RNA與膜上的M6A修飾的RNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合m6A抗體译隘，表明m6A抗體與m6A修飾的RNA結(jié)合而與未修飾的RNA不結(jié)合亲桥。

隨后作者通過(guò)檢測(cè)不同組織中m6A說(shuō)明神經(jīng)組織的RNA甲基化比其他組織高，并且在整個(gè)大腦發(fā)育過(guò)程中m6A含量豐富固耘。作者用寡聚核苷酸（dT）進(jìn)行RNApull-down釣取細(xì)胞Mrna后用m6A抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)說(shuō)明mRNA的甲基化题篷，然后通過(guò)寡聚核苷酸（dT）雜交獲取的mRNA用RNaseH（一種降解polyA尾的RNA水解酶）處理后再進(jìn)行免疫檢測(cè)說(shuō)明Mrna的m6a修飾不是在poly(A)尾上。

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圖注：A是小鼠不同組織RNA的m6A檢測(cè)厅目，B是小鼠生長(zhǎng)不同階段的大腦組織RNA的m6A檢測(cè)番枚，C是用寡聚核苷酸Dt序列釣取細(xì)胞的mRNA然后檢測(cè)m6A，D是釣取的Mrna用RnaseH去除Mrna的poly(A)尾后檢測(cè)m6A璧瞬。

2、MeRIP-Seq檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組中含m6A的RNA

為了檢測(cè)RNA上的m6A渐夸，作者通過(guò)MeRIP先將細(xì)胞總RNA片段化為大約100bp左右嗤锉，用m6A抗體釣取細(xì)胞含m6A的RNA片段，然后進(jìn)行高通量測(cè)序分析m6A的位置墓塌，表明大部分的m6A在mRNA的3’端瘟忱。隨后作者用其中的Ldlr mRNA的反向互補(bǔ)序列作為探針釣取細(xì)胞的Ldlr mRNA進(jìn)行m6A的免疫反應(yīng)驗(yàn)證。

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圖注：A為MeRIP-Seq的數(shù)據(jù)分析中mRNA甲基化的信息苫幢，B為L(zhǎng)dlr mRNA的RNA-RNApull-down后進(jìn)行m6A免疫檢測(cè)驗(yàn)證Ldlr mRNA甲基化访诱。

MeRIP-Seq數(shù)據(jù)分析表明m6A集中在在motif G[AG]ACU和其變體[AC]GAC[GU],GGAC, [AU][CG]G[AG]AC上，并且在U-rich的motif上幾乎不含m6A韩肝。

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3触菜、本文所用的主要研究方法

（1）dot blot：斑點(diǎn)雜交印跡法。

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先將m6A修飾的RNA固定在尼龍膜上哀峻，然后用m6A抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)涡相，分別用m6A修飾的RNA和未修飾的RNA作為m6A抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合探針，在加入m6A修飾的RNA時(shí)剩蟀，隨著加入的RNA量增加催蝗，抗體與膜上的RNA反應(yīng)降低；而加入非修飾的RNA時(shí)育特，抗體與膜上的RNA反應(yīng)不受影響

（2）MeRIP-Seq：m6A特異性的甲基化RNA免疫沉淀技術(shù)

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MeRIP-Seq實(shí)驗(yàn)方法：先將提取的細(xì)胞總RNA進(jìn)行片段化處理丙号，然后與m6A抗體一起孵育，再用磁珠吸附m6A抗體與m6A-RNA的復(fù)合體，洗脫的RNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序犬缨。

（3）RNA-RNA pull-down

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作者用Ldlr mRNA的互補(bǔ)序列探針進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)釣取細(xì)胞的Ldlr Mrna喳魏，然后用m6A抗體進(jìn)行WB檢測(cè)pull-down產(chǎn)物，表明Ldlr Mrna上含有m6A富集遍尺。CTL探針的pull-down產(chǎn)物作為對(duì)照截酷。

文獻(xiàn)原文：Kate D. Meyer,Yogesh Saletore,PaulZumbo,et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in3' UTRs and Near Stop Codons[J].Cell, 2012,149(7): 1635–1646