Nat Biotech | 深部組織多光子成像非侵入式研究大腦結(jié)構(gòu)和功能

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?2022-06-26 10:50?發(fā)表于江蘇

收錄于合集#前沿分子生物學(xué)技術(shù)

撰文：huacishu

IF=54.98

推薦度：?????

亮點：

1、作者在多項?AO?顯微成像技術(shù)的基礎(chǔ)上放前，開發(fā)了一種新型活體自適應(yīng)光學(xué)三光子顯微成像（AO-3PM）系統(tǒng)忿磅，該系統(tǒng)結(jié)合全新自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)和三光子顯微成像，實現(xiàn)了穿過活體小鼠完整頭骨在大腦深層的高分辨率成像凭语；

2葱她、該系統(tǒng)大幅提升了非侵入式活體成像的圖像質(zhì)量，為無損的研究大腦結(jié)構(gòu)和功能提供了強有力的工具和方法似扔。

香港科技大學(xué)Jianan Y. Qu（瞿佳男）教授課題組在國際知名期刊Nat Biotechnol在線發(fā)表題為“Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping”的論文吨些。由于生物物質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)引起的光學(xué)像差和光散射搓谆，組織深處的高分辨率光學(xué)成像成為了一個具有挑戰(zhàn)性的問題。本研究作者提出了一種自適應(yīng)光學(xué)三光子顯微鏡（ALPHA-FSS）豪墅，ALPHA-FSS可準確測量并有效補償標本引起的像差和散射泉手，并恢復(fù)亞細胞分辨率。具有遠程聚焦的共軛自適應(yīng)光學(xué)配置能夠通過完整顱骨下方750μm的深度對小鼠皮質(zhì)中的精細神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進行活體成像偶器，從而實現(xiàn)皮質(zhì)中的近無創(chuàng)高分辨率顯微鏡檢查斩萌。作者還展示了通過完整顱骨進行高靈敏度和高精度激光介導(dǎo)顯微手術(shù)的功能性鈣成像。此外屏轰，還實現(xiàn)了完整腦內(nèi)深皮質(zhì)和皮質(zhì)下海馬體的活體高分辨率成像颊郎。

作者提出的共軛α-FSS–3PM系統(tǒng)由三個關(guān)鍵模塊組成，即直接聚焦傳感霎苗、共軛自適應(yīng)光學(xué)（AO）和遠程聚焦模塊姆吭，如圖1a所示。為了評估α-FSS–3PM的效果并表征其在穿透顱骨成像中的性能唁盏，作者首先進行了一項體外實驗内狸，通過在切除的完整顱骨下方將熒光珠嵌入瓊脂糖中進行成像。為了測量波前畸變升敲，強光束停在最亮的區(qū)域例如熒光珠的中心答倡，而弱光束用于掃描16×16 μm2的視野（FOV），以捕獲復(fù)雜的電場點擴散函數(shù)（PSF）驴党。然后瘪撇，通過使用測量的E場PSF的二維傅里葉變換，即可快速準確地確定并有效地校正總體像差港庄【蠹龋可以看出，僅通過系統(tǒng)像差校正記錄的熒光珠圖像高度失真鹏氧，旁瓣的出現(xiàn)表明由厚顱骨引起的高階像差（圖1b）渤涌。

相反，通過將校正相位模式應(yīng)用于空間光調(diào)制器（SLM）以補償樣品引起的像差（圖1c）把还，有效地恢復(fù)了高成像分辨率实蓬，并將熒光強度提高了200倍以上（圖1b，d）吊履。但是安皱，衍射限制分辨率沒有完全恢復(fù)，可能是由于剩余的未校正散射引起的艇炎。在AO顯微鏡系統(tǒng)中酌伊，波前校正器通常投影到物鏡的后瞳孔平面。這種稱為瞳孔AO的配置幾乎在所有AO顯微鏡中都有實現(xiàn)缀踪。然而居砖，瞳孔AO校正只能在非常小的FOV（<30μm直徑）上恢復(fù)聚焦質(zhì)量虹脯，如圖1e所示。為了在單AO校正的情況下獲得更大的有效成像體積奏候，作者將共軛AO與遠程聚焦相結(jié)合循集。使用快速電可調(diào)諧透鏡（ETL）進行掃描，遠程聚焦引起的像差被計算為系統(tǒng)像差的一部分鼻由，并在α-FSS AO校正之前由DM進行校正暇榴。作者測量了在瓊脂糖中直徑為0.2 μm的無像差熒光珠樣品中厚棵，作為焦點調(diào)諧距離函數(shù)的遠程聚焦的分辨率蕉世。在所有體外和體內(nèi)研究中，以實驗測量的分辨率作為基準來評估共軛α-FSS–3PM的性能婆硬。對于深度>400 μm的成像狠轻，激發(fā)光束大于SLM，導(dǎo)致分辨率降低彬犯。如圖1f向楼、g所示，共軛AO單次校正后的有效FOV在橫向和縱向上分別擴展至150 μm和400 μm谐区，與瞳孔AO配置相比湖蜕，校正體積增加了100倍以上。此外宋列，由于掃描是通過遠程聚焦實現(xiàn)的昭抒，無需物鏡和波前校正器的物理平移，因此可以輕松實現(xiàn)不同成像平面的快速掃描炼杖。

接下來灭返，作者驗證了結(jié)合α-FSS–3PM通過完整顱骨改善活體腦成像的能力。在成年Cx3Cr1 GFP小鼠的結(jié)合AO構(gòu)型中獲得了綠色熒光蛋白（GFP）標記的小膠質(zhì)細胞的活體圖像坤邪。使用傳統(tǒng)的3P顯微鏡（系統(tǒng)AO校正）幾乎無法識別完整顱骨下方300 μm處小膠質(zhì)細胞的詳細結(jié)構(gòu)熙含。通過使用GFP信號的直接聚焦傳感，AO有效地補償了樣本誘導(dǎo)的像差艇纺，并恢復(fù)了小膠質(zhì)細胞的過程怎静，但其有效FOV被限制在30 μm以下。相比之下黔衡，共軛AO不僅在分辨率和信號強度方面提供了與瞳孔AO類似的改進蚓聘，能夠清晰地分辨小膠質(zhì)細胞過程，但也能將校正后的FOV大幅放大至120 μm员帮。此外或粮，結(jié)合遠程聚焦的AO能夠在100 μm至500 μm的成像深度上有效提高成像分辨率（圖1e–g）。

研究發(fā)現(xiàn)捞高，盡管腦深部區(qū)域（例如490 μm處）的像差可能需要覆蓋更大顱骨區(qū)域的校正相位模式氯材，但在300 μm處測得的校正波前仍顯示出較好的信號強度渣锦。簡而言之，在當前深度測量的附加校正相位被添加到先前深度測量的相位氢哮，以生成完整AO校正的最終和最佳相位模式袋毙。這樣，可以有效地測量深度上的像差冗尤，進一步提高信號強度和空間分辨率听盖。這些結(jié)果揭示了結(jié)合α-FSS AO的巨大優(yōu)勢，該AO具有遠程聚焦功能裂七，可在大體積上通過完整顱骨對小鼠皮質(zhì)進行活體高分辨率成像皆看。

接下來，通過完整的顱骨對小鼠大腦皮層的神經(jīng)元和血管結(jié)構(gòu)進行了活體成像背零。圖2a顯示了一只成年Thy1 YFP轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)腰吟，其頭骨厚度為100 μm。在這里徙瓶，用單波長（1300 nm）3P激發(fā)毛雇，實現(xiàn)了YFP標記的錐體神經(jīng)元和腦微血管的雙色熒光成像≌煺颍可以看出灵疮，即使校正了系統(tǒng)像差，通過完整顱骨的3P成像中的對比度和分辨率也會隨著深度的增加而迅速降低（圖2a）壳繁，這主要是因為顱骨誘發(fā)的像差引起的激發(fā)PSF失真震捣。因此，熒光發(fā)射水平非常低的神經(jīng)元樹突氮趋，在200 μm深度以上的完整顱骨中伍派，常規(guī)3P成像幾乎無法觀察到。使用高靈敏度的α-FSS方法剩胁，激發(fā)光所經(jīng)歷的像差和散射都可以準確確定并有效校正诉植。通過這種方式，最佳PSF的AO恢復(fù)導(dǎo)致分辨率大大提高昵观，信號顯著增強（高達40倍）晾腔，使得精細結(jié)構(gòu)，如神經(jīng)元樹突啊犬，可以通過完整的顱骨清晰可見（圖2b-i）灼擂。但是，活體成像中的信號改善程度小于完整顱骨下方相同深度處熒光珠的信號改善程度觉至。這可能是由于運動效應(yīng)剔应，如心跳和呼吸，將不可避免地導(dǎo)致體內(nèi)PSF測量的誤差；皮質(zhì)組織的散射也在一定程度上降低了信號的增加峻贮。有趣的是席怪，圖2d、h中的校正相位圖案在中心區(qū)域中更平滑纤控。這可能是因為入射角較低的中心光線進入樣品時挂捻，光與組織的相互作用長度較短，因此船万，與邊緣光線相比刻撒，其像差和散射較小。AO校正后耿导，微血管結(jié)構(gòu)的全顱骨成像也得到了顯著改善声怔，深度處的信號背景比（SBR）大大增加。

借助快速直接聚焦傳感碎节，作者還將α-FSS–3PM應(yīng)用于神經(jīng)元活動的功能性鈣成像捧搞。為了使直接聚焦傳感有效工作，在熒光波動的聚焦傳感過程中狮荔，將鎖定檢測信號的輸出歸一化為熒光信號。這樣介粘，可以消除由快速變化的鈣熒光引起的測量的E場PSF中的偽影殖氏，從而能夠準確地確定像差。接下來姻采，通過完整的顱骨對CCK-GCaMP6s轉(zhuǎn)基因小鼠皮層中的GCaMP6s標記神經(jīng)元進行活體鈣成像雅采。如圖3所示，僅使用AO系統(tǒng)慨亲，樹突的鈣信號變得無法檢測婚瓜，因為背景噪音過大。通過α-FSS AO校正刑棵，來自神經(jīng)元胞體和樹突的熒光信號顯著增加巴刻，分辨率顯著提高，從而能夠記錄同步的軀體-樹突活動（圖3d蛉签，e）胡陪。此外，由于共軛AO通過遠程聚焦方法提供了大的成像體積和快速的掃描碍舍，展示了通過完整顱骨的不同皮質(zhì)層的神經(jīng)元和樹突活動的近同步多平面鈣成像柠座。

小膠質(zhì)細胞在腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用。具有高分辨率的非侵入性成像工具對于研究小膠質(zhì)細胞生理學(xué)至關(guān)重要片橡。利用α-FSS-AO方法妈经，通過對Cx3Cr1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細胞的頭骨成像進行了體內(nèi)研究。如圖4a–c所示，共軛AO持續(xù)提高了圖像分辨率和熒光信號吹泡，使我們能夠在大成像體積上解析小膠質(zhì)細胞的精細過程录煤，否則，如果沒有完全AO校正荞胡，就無法識別妈踊。此外，α-FSS使我們能夠通過完整的顱骨進行精確的激光顯微手術(shù)泪漂，這是研究各種病理條件下的細胞機制的有力技術(shù)廊营。多個深度的延時成像顯示，高度局限性病變僅激活少數(shù)相鄰的小膠質(zhì)細胞（在50μm的距離內(nèi)）萝勤，這些小膠質(zhì)細胞以協(xié)調(diào)的方式迅速向病變延伸（圖4a）露筒。這些結(jié)果表明，除了通過完整顱骨對大腦進行高分辨率成像外敌卓，α-FSS在精確光學(xué)操作方面具有巨大潛力慎式。最后，作者評估了結(jié)合α-FSS AO分別對頭骨較厚（130–140 μm）的老齡（>10個月）小鼠和頭骨機械變碧司丁（約50 μm）的小鼠進行活體皮質(zhì)成像的能力進行了考察瘪吏。結(jié)果表明，AO輔助顱骨成像方法可以促進老齡小鼠大腦的活體研究蜗巧，并且通過薄的顱骨比通過完整的顱骨獲得更好的性能掌眠。此外，還通過對阿爾茨海默材灰佟（AD）小鼠模型中小膠質(zhì)細胞的頭骨成像進行了體內(nèi)研究蓝丙，在該模型中，淀粉樣斑塊通過衰老在大腦中積聚望拖，被認為是AD病理的機制渺尘。淀粉樣斑塊周圍的小膠質(zhì)細胞的形態(tài)可以通過140 μm厚的完整顱骨清楚地分辨出來，如果沒有完全AO校正说敏，這些是無法識別的（圖4d）鸥跟。觀察到的斑塊相關(guān)小膠質(zhì)細胞的形態(tài)與之前的研究一致。

為了進一步推進成像深度像云，通過一個打開的顱骨窗口進行了3P成像锌雀，其中一部分顱骨被一塊透明玻璃所取代，以提供直接的光學(xué)訪問大腦迅诬。在體內(nèi)對整個大腦皮層的錐體神經(jīng)元進行成像腋逆，如圖5a所示。在這里侈贷，α-FSS導(dǎo)致3P信號顯著增加（約9倍）惩歉，并恢復(fù)最深皮質(zhì)層的突觸分辨率等脂，從而使基底樹突的單個棘清晰可見（圖5b-d）。由于厚而分散的大腦皮層所施加的限制撑蚌，在不使用高侵入性程序的情況下上遥，實現(xiàn)皮質(zhì)以外和皮質(zhì)下區(qū)域（例如海馬）的活體高分辨率成像仍然是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。先前關(guān)于海馬體內(nèi)3P成像的研究提供了細胞水平的成像分辨率争涌。如圖5e所示粉楚，盡管在常規(guī)3P成像中可以識別海馬CA1中的神經(jīng)元胞體，但樹突結(jié)構(gòu)仍然無法清晰識別（圖5e亮垫，i）模软。然而，使用α-FSS AO饮潦，顯著改善了3P熒光信號燃异，并成功恢復(fù)了突觸分辨率，使海馬CA1神經(jīng)元的頂端樹突清晰分辨（圖5e-l）继蜡。

在這項研究中回俐，作者開發(fā)了一種AO 3PM技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了兩項創(chuàng)新：具有相位敏感檢測的直接聚焦傳感和具有遠程聚焦的共軛AO稀并。相位敏感檢測技術(shù)對于準確測定散射和像差焦場至關(guān)重要仅颇，因此可以有效校正樣品引起的像差和散射。作者進行了一系列實驗稻轨，詳細比較了α-FSS中使用的鎖相檢測相位調(diào)制法和之前研究中使用的相位步進法在電場測量中的效果灵莲。作者發(fā)現(xiàn)，采用鎖相檢測方法的相位調(diào)制的信噪比（SNR）通常高于相位步進法殴俱，這表明相敏檢測方法在抑制噪聲方面具有優(yōu)越的性能，能夠準確快速地校正樣品引起的畸變枚抵。當相位步進在多個周期中執(zhí)行時线欲，α-FSS中的鎖定相位檢測和F-SHARP中的相位步進在信號分析方面基本上是等效的。與F-SHARP不同汽摹，α-FSS可以將相敏檢測的頻率推至MHz范圍李丰，這是由于1/F激光噪聲的優(yōu)勢。結(jié)合遠程聚焦的共軛AO確保了單個校正相位模式可以在單個大成像體積上恢復(fù)高成像分辨率逼泣。使用α-FSS–3PM系統(tǒng)趴泌，通過完整的顱骨進行了活體腦成像，這是一種理想的近乎無創(chuàng)但也極具挑戰(zhàn)性的方法拉庶。通過校正標本引起的畸變嗜憔，通過完整的顱骨實現(xiàn)了小鼠皮質(zhì)的活體高分辨率成像。由于直接聚焦感應(yīng)的速度很快氏仗，在深度顯示了密集標記神經(jīng)元的活體功能性鈣成像吉捶，大大提高了靈敏度和準確性。作者還通過完整的顱骨和小膠質(zhì)細胞反應(yīng)的高分辨率動態(tài)成像展示了精確的激光顯微手術(shù)。我們的研究結(jié)果表明呐舔，α-FSS技術(shù)在推進活體成像技術(shù)和促進活體腦神經(jīng)科學(xué)研究方面具有巨大潛力币励。應(yīng)該注意的是，盡管紅細胞運動產(chǎn)生的偽影會略微影響精度珊拼，直接聚焦傳感也可以通過來自血管的熒光信號來實現(xiàn)食呻。雖然已經(jīng)證明了α-FSS-3PM在1300 nm激發(fā)下進行腦深部成像的能力，但它可以毫無困難地應(yīng)用于1700 nm激發(fā)澎现。理論上仅胞，對于更大的成像深度，1700 nm處的3P激發(fā)是有利的昔头，因為其有效衰減長度更長饼问。然而，由于最大激發(fā)功率不應(yīng)超過100 mW以避免組織損傷揭斧，由于3P激發(fā)效率低莱革，成像深度受到大腦深層微弱信號的限制。據(jù)報道讹开，量子點的3P激發(fā)截面比傳統(tǒng)熒光染料的3P激發(fā)截面大4–5個數(shù)量級盅视，并且能夠在高達2.1毫米的深度下對小鼠腦血管進行3P成像。由于來自血管的3P熒光信號也可用于α-FSS旦万，因此它可以作為腦深部區(qū)域畸變完全校正的起點闹击，從而顯著增強用熒光標記的細胞結(jié)構(gòu)的熒光強度。

教授介紹

瞿佳男博士于1983年和1986年分別獲得華中科技大學(xué)光學(xué)工程學(xué)士和碩士學(xué)位成艘。1990年獲中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機械研究所光學(xué)博士學(xué)位赏半。此后，他在加州大學(xué)歐文分校物理系工作了一年淆两，并在不列顛哥倫比亞癌癥研究中心擔(dān)任博士后研究員兩年多断箫。瞿博士現(xiàn)為香港科技大學(xué)電子及計算機工程系教授。瞿博士是美國光學(xué)學(xué)會（OSA）和國際光學(xué)與光子學(xué)學(xué)會（SPIE）的當選會員秋冰。他是《光學(xué)快報》和《生物醫(yī)學(xué)光學(xué)雜志》的專題編輯和編輯委員會成員仲义。他的研究目標是為醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)中的問題提供工程解決方案。這一研究方向涵蓋了應(yīng)用于醫(yī)學(xué)成像剑勾、生物醫(yī)學(xué)光學(xué)和生物光子學(xué)埃撵、神經(jīng)工程、醫(yī)學(xué)電子學(xué)虽另、生物信息學(xué)/計算生物學(xué)暂刘、生物信號處理、生物醫(yī)學(xué)微器件和生物醫(yī)學(xué)材料的工程原理和材料技術(shù)洲赵。

參考文獻

Qin Z, She Z, Chen C, et al. Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping. Nat Biotechnol. 2022;10.1038/s41587-022-01343-w. doi:10.1038/s41587-022-01343-w