常用的病毒載體有腺病毒将饺、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒湖饱。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞蚓庭，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色體上咳榜，只能進(jìn)行瞬時(shí)感染畔柔。與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒（LV）具有可以感染非分裂期細(xì)胞臣樱、容納外源性基因片段大释树，可以長期表達(dá)等顯著優(yōu)點(diǎn)肠槽。
慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體奢啥，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力秸仙。慢病毒感染的顯著特點(diǎn)是感染個(gè)體在出現(xiàn)典型的臨床癥狀之前，大多經(jīng)歷長達(dá)數(shù)年的潛伏期桩盲，之后緩慢發(fā)病寂纪，因此這些病原體被稱為慢病毒。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快赌结，研究的也非常深入捞蛋。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)柬姚。
慢病毒質(zhì)粒
pLV-IRES-PuroR
構(gòu)建索引文件
hisat2-build -p 2 addgene-plasmid-128652-sequence-320737.fa pLV_IRES_GFP
raw reads過濾
mkdir -p fastp
ls *.fastq.gz|while read id;
do
fastp -5 20 -3 20 -i $id -o ${id%%.*}.clean.fq.gz \
-h ./fastp/${id%%.*}.html -j ./fastp/${id%%.*}.json;
done
比對
ls *clean.fq.gz |while read id
do
hisat2 -t -q -p 2 \
-x /media/lzx/0000678400004823/Indexs/Hisat2/plasmids/pLV_IRES_GFP \
-U $id 2>${id%%.*}.hisat2.log \
| samtools sort -@ 2 -o ${id%%.*}_ht2p.bam
done
IGV查看
發(fā)現(xiàn)基因間都是分開的拟杉，也就是說有很多的gap
zcat SRR9625467.clean.fq.gz |grep TCCTCGCCCTTGCTCACCAT
grep TCCTCGCCCTTGCTCACCAT
zcat SRR9625467.clean.fq.gz |grep CTTGTACAGCTCGTCCATGC
grep CTTGTACAGCTCGTCCATGC
zcat SRR9625467.clean.fq.gz |grep GTGGGCTTGTACTCGGTCAT
grep GTGGGCTTGTACTCGGTCAT
zcat SRR9625467.clean.fq.gz |grep AGGCACCGGGCTTGCGGGTC
grep AGGCACCGGGCTTGCGGGTC
grep結(jié)果顯示這些基因的編碼序列之間并不是獨(dú)立的。
提取未必對序列
ls *.bam |while read id
do
samtools fastq -@ 2 -f 4 $id >${id%%_*}.unmap.fq;
gzip ${id%%_*}.unmap.fa
done
Trinity組裝
ls *unmap.fq.gz |while read id
do
Trinity --seqType fq --max_memory 11G --single $id --SS_lib_type R --CPU 4 --min_contig_length 1000 --output ${id%%_*}> ${id%%_*}.trinity.log 2> ${id%%_*}.trinity_err.log
done
再比對
