Save Time with Transient Plant Leaf Transformations

與植物一起工作并不總是一個耗時的過程不从。雖然在組織培養(yǎng)中培育轉(zhuǎn)基因毛狀根需要半年時間簸呈，而培育轉(zhuǎn)基因植物可能需要更長的時間晾捏，但一個短暫的植物葉片轉(zhuǎn)化過程可以為植物生物學(xué)家節(jié)省一些時間(…)。實(shí)際上是幾個月歧焦。

在李帕森實(shí)驗室，我們正在研究癌癥治療藥物長春新堿和長春新堿的生產(chǎn)是如何在藥用植物中得到控制的肚医。長春花(圖1)我們研究的最終目標(biāo)是提高它們在植物或植物組織培養(yǎng)中的產(chǎn)量绢馍。

玫瑰C.不是一個典型的有機(jī)體，例如擬南芥或者煙草肠套。研究基因功能玫瑰C.由于方法的可用性而受到很大的限制舰涌。感染發(fā)根農(nóng)桿菌可用于組織培養(yǎng)中發(fā)育穩(wěn)定的毛狀根系。這種方法常用于玫瑰C.但在毛狀根中不能研究光合活性組織的過程糠排，因為根中缺少功能葉綠體和葉特異性細(xì)胞類型舵稠。轉(zhuǎn)基因毛狀根的發(fā)育至少需要6個月的時間。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物所需的時間更長，勞動強(qiáng)度更大哺徊，效率更低室琢，而且往往無法復(fù)制。在建立轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)或植物之前落追，我們的瞬時表達(dá)方法使我們能夠快速篩選和研究轉(zhuǎn)錄因子候選物和生物合成途徑中的基因調(diào)控盈滴。

為什么植物科學(xué)家會做短暫的葉片轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展是非模式生物普遍存在的問題。因此轿钠，瞬態(tài)方法通常是研究基因功能的首選方法巢钓，因為這些實(shí)驗可以在幾天到幾周內(nèi)完成，而不是幾個月到幾年疗垛。在植物科學(xué)中症汹，“瞬時轉(zhuǎn)化”通常指的是一個穩(wěn)定的細(xì)胞系或植物不能從轉(zhuǎn)化的組織中再生〈螅基因功能通常通過瞬時沉默和/或在植物中過度表達(dá)感興趣的基因來研究背镇。

基因沉默的常用方法

病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)是一種利用病毒和植物轉(zhuǎn)錄后機(jī)制來沉默感興趣基因的短暫技術(shù)(Unver和Budak，2009年)泽裳。這種方法適用于玫瑰C..

一種常見的過表達(dá)基因的方法

在像這樣的植物中擬南芥和煙草瞒斩，農(nóng)桿菌滲透到葉片中是一種簡單而有效的表達(dá)基因和評價其功能的方法。本質(zhì)上農(nóng)桿菌包含一個帶有T-DNA(轉(zhuǎn)移-DNA)區(qū)域的質(zhì)粒涮总。在感染過程中胸囱，這個T-DNA區(qū)域被轉(zhuǎn)移到植物中.在實(shí)驗室里，我們可以利用這一自然過程瀑梗，用我們感興趣的基因或報告基因替換T-DNA區(qū)域上的基因烹笔，從而跟蹤轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)。在短暫的葉片轉(zhuǎn)化過程中夺克，農(nóng)桿菌該菌株與葉片組織接觸箕宙，并將帶有感興趣基因的T-DNA區(qū)域轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。但為了C.?玫瑰,?農(nóng)桿菌滲透到葉子里不起作用铺纽。,因為葉子有蠟質(zhì)柬帕，很難滲透。

我們最近克服了這個問題玫瑰C.通過與幼苗一起工作并優(yōu)化過渡轉(zhuǎn)化過程的其他幾個方面(Mortensen等人狡门，2019年)陷寝。我們的方法也可以為其他物種的瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的開發(fā)提供一些有用的指導(dǎo)。

開發(fā)瞬態(tài)葉轉(zhuǎn)換方法時應(yīng)考慮的問題農(nóng)桿菌:

如果您是這個領(lǐng)域的新手其馏，以下是您第一次短暫的葉轉(zhuǎn)換的有用提示：

檢查您的種族是否有可用的工作協(xié)議凤跑。

這會幫你節(jié)省很多時間。別再發(fā)明輪子了叛复。

測定不同葉齡

通常較年輕的葉子工作得更好仔引。并不是每一片葉子都同樣容易發(fā)生短暫的轉(zhuǎn)化扔仓。

選擇好的報告基因

有很多偉大的報告基因可用的和您選擇的取決于您的實(shí)驗(de Ruijter等人，2003年)咖耘。例如翘簇，我們對GUS基因進(jìn)行了初步的轉(zhuǎn)換，以確定轉(zhuǎn)化是否成功儿倒。一旦我們走上正軌版保，我們就轉(zhuǎn)向熒光素酶，更容易量化不同治療方法對轉(zhuǎn)化成功的影響夫否。下面是一些報告基因的例子彻犁。

GUS基因(β-葡萄糖醛酸酶)用組織化學(xué)GUS染色是一個非常有用的視覺報告(圖2)。GUS酶切割一個底物凰慈，然后形成藍(lán)色沉淀汞幢。GUS通常是建立一個新的轉(zhuǎn)換協(xié)議的首選，因為它可以很容易地顯示哪些組織已經(jīng)被轉(zhuǎn)化溉瓶。但是要注意：檢查你組織中的GUS樣活動急鳄。使用農(nóng)桿菌缺乏GUS基因，因為植物可以內(nèi)源性Gus樣活性(Hu等人堰酿，1990年)。我們通常使用PSB 161-PL2_pSB 90_2x35S：：GUS：：TMA以確認(rèn)轉(zhuǎn)化成功张足。

熒光素酶是一種很好的定量報告触创，并利用底物產(chǎn)生生物發(fā)光。熒光素酶通常比GUS具有更短的mRNA和蛋白半衰期为牍，因此是測定啟動子活性的好時機(jī)記者哼绑。有用的積極控制可包括：PSB 96-PL2_pSB 90_2x35S：：Fluc-I：：TNO?&?PSB 166-PL2_pSB 90_TMAs：：rLUC-I：：PMA.

熒光蛋白(FP，例如GFP)可以以多種方式使用碉咆。通常抖韩，F(xiàn)P與感興趣的蛋白質(zhì)融合，以闡明你感興趣的蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位疫铜。

從Lee-Parsons實(shí)驗室找到所有的質(zhì)粒茂浮。

不同入滲方法試驗

共育(Li等人，2009年)：農(nóng)桿菌與你的葉子是一個非常容易的轉(zhuǎn)化方法壳咕，但可能是低效的許多物種席揽。更有效的是注射器或真空滲透。

注射器滲透(d‘Aoust等人谓厘，2009年)：通常用沒有針頭的注射器注射農(nóng)桿菌通過氣孔培養(yǎng)進(jìn)入葉的背面(下表面)幌羞。這是一種簡單容易實(shí)現(xiàn)的技術(shù)。成功可能因?qū)嶒炚叨悺?/p>

真空滲透(Mortensen等人竟稳，2019年)：葉子或整株植物被放置在農(nóng)桿菌溶液和真空用真空鐘或干燥器属桦。成功的浸潤通承艹眨可以通過組織的下沉來觀察(見圖3)。這種方法可能是最可伸縮的方法聂宾。

把你的植物移到黑暗里在改造前16小時.

我們通常在轉(zhuǎn)化前16小時將我們的植物轉(zhuǎn)移到黑暗中愁拭，在轉(zhuǎn)化后的黑暗中再給它們留下兩天的時間。

使用內(nèi)含子

植物促進(jìn)劑可以被識別或泄漏在農(nóng)桿菌亏吝。這對于報告基因來說尤其有問題岭埠，因為您可能會從農(nóng)桿菌，但不是植物蔚鸥。例如惜论，我們看到了古斯具有CaMV35S啟動子的基因農(nóng)桿菌。通過使用內(nèi)含子可以很容易地避免這種情況止喷，這些內(nèi)含子將從植物的轉(zhuǎn)錄本中刪除馆类，但不能從植物中刪除。農(nóng)桿菌.

試驗不同農(nóng)桿菌菌株

我們用被解除的武器根癌農(nóng)桿菌GV 3101菌株(PMP 90)弹谁，對我們很有效乾巧。

使用工作良好的矢量系統(tǒng)

這使得您可以快速地組裝向量并測試不同的想法。我們是超級粉絲基于金門的MoClo系統(tǒng).?上面的博客文章中提到的向量已經(jīng)準(zhǔn)備好使用向量预愤，但是使用MoClo系統(tǒng)沟于，您可以輕松、快速地創(chuàng)建自定義向量植康。有關(guān)植物的MoClo的更多信息旷太，請查看以下內(nèi)容采訪尼古拉贊助人，分享MoClo植物試劑盒.

對我們來說销睁，瞬時葉片轉(zhuǎn)化對篩選候選基因和加快研究是很有幫助的供璧。當(dāng)然，暫時的葉轉(zhuǎn)換還有更多冻记，但是我們希望這些技巧可以幫助您開始工作睡毒。一旦你在你的實(shí)驗室建立了一個良好的協(xié)議，它就可以成為你的研究的有力工具冗栗。歡迎在下面的評論中添加更多的技巧和經(jīng)驗演顾。

References

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