2018年Cell Systems文章：Dissection of Influenza Infection?In?Vivo?by Single-Cell RNA Sequencing飘诗，參考用于單細胞轉錄組測序在病毒感染中的應用博肋。
導讀
流感病毒是全世界發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。然而，細胞內病毒復制的影響和不同細胞類型的宿主反應的變化仍然未得到詳細描述。本文中废菱，研究者使用單細胞RNA測序來研究肺組織細胞對體內流感感染反應的異質性。對同一單個細胞中病毒和宿主轉錄體的分析使研究者能夠探究旁近細胞（暴露但未感染）與感染細胞相比的細胞異質性。盡管與上皮細胞相比病毒轉錄體負荷較低殊轴，所有主要的免疫細胞和非免疫細胞類型都表現(xiàn)出高感染率衰倦。結果顯示所有細胞類型的反應主要是一個強大的通用轉錄反應，并且本研究揭示了流感感染的新特異性標記旁理。這些發(fā)現(xiàn)為特異性針對感染細胞的靶向治療開辟了新的途徑樊零。
文章簡介
原名：Dissection of Influenza Infection?In Vivo by Single-Cell RNA Sequencing
譯名：單細胞RNA測序解析流感病毒體內感染
期刊：Cell Systems
IF：8.64（一區(qū)）
發(fā)表時間：2018年
通訊作者：Ido Amit、Irit Gat-Viks
作者單位：以色列特拉維夫大學生命科學學院細胞研究和免疫學系
結果
應用宿主和病毒轉錄組聯(lián)合單細胞定位技術分析體內流感感染
為了無偏見的同時研究流感病毒感染后的宿主和病毒轉錄狀態(tài)孽文，研究者使用流感感染2天后獲得的小鼠（5.5-6.5周齡的雌性C57BL / 6J小鼠）肺細胞進行單細胞RNA測序淹接。首先使用熒光活化細胞分選（FACS）分離免疫（CD45+）和非免疫（CD45-）來自流感處理和PBS（“對照”）處理小鼠肺的細胞。然后使用了大規(guī)模平行的單細胞RNA-seq方法叛溢，對所有聚腺苷酸mRNA進行了分析（圖1）。分別從經流感處理的小鼠和對照小鼠中分析了2034和2146個細胞劲适。為了評估數(shù)據(jù)的質量楷掉，研究者確定了與對照相比，從經流感處理的小鼠分離的細胞中差異表達的基因霞势。結果這些基因在抗病毒相關的信號傳導途徑中被過度表達（如IFN信號傳導和Irf7信號傳導）烹植。
單細胞的聚集可區(qū)分不同的細胞類型愕贡。聚類注釋結果：產生了9個較大的細胞簇草雕，共有4064個細胞，包括非免疫細胞類型的來源：上皮細胞（EP）固以、淋巴管和血管內皮細胞（LEC和BEC）墩虹、成纖維細胞（FIB）和5種特殊的免疫細胞類型：粒細胞（GN）、Tcells憨琳、Bcells诫钓、NKcells和樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞的聯(lián)合簇篙螟，統(tǒng)稱為單核吞噬細胞系統(tǒng)（MPS）（圖1B）菌湃。為了確定細胞是否確實通過細胞類型而不是通過處理或通過細胞內病毒基因轉錄而聚集，根據(jù)與先前分選的大細胞亞群的整體表達的最佳匹配對每個單個細胞進行注釋遍略【逅基于大量轉錄組數(shù)據(jù)的單個細胞的注釋與基于標記的這些簇的注釋一致。研究者進一步使用t-SNE將不同的細胞亞群投射到二維空間绪杏。正如預期的那樣下愈，具有相同細胞類型的細胞形成獨立于處理（流感處理與對照）的單獨tSNE簇（圖1C和1D）。
由于病毒mRNA（vmRNA）已被聚腺苷酸化蕾久，因此MARS-seq可以捕獲每個單個細胞內的病毒mRNA和宿主mRNA（圖1 A）驰唬。研究者從與病毒片段對齊的唯一分子標識符（UMI）的數(shù)量推斷出細胞內的病毒載量。具體而言，病毒載量定義為給定細胞的總UMI含量中病毒UMI（即與病毒片段之一對齊的UMI）的比例叫编。因此定義了三類細胞：（1）“感染細胞”辖佣，其病毒載量高于某個選定的病毒載量臨界值；（2）“旁近細胞”搓逾，即源自經流感處理的小鼠但未檢測到表達任何vmRNA（病毒載量為零）的細胞卷谈；（3）“未暴露的細胞”，即從未感染過的對照小鼠衍生的細胞（圖1A）霞篡。結果觀察到世蔗，細胞分組正確地預測了高比例的真正感染細胞。
感染細胞的高流行是所有主要細胞類型的特征
首先探討了九種主要細胞類型中每種細胞的感染率朗兵。研究者集中研究了攜帶至少0.05％病毒載量的受感染細胞污淋。基于此臨界值余掖，研究者為每種細胞類型計算了來自流感處理小鼠的細胞中被感染細胞的百分比寸爆。有趣的是，在九種細胞類型的每一種中均觀察到相對較大百分比的感染細胞盐欺，其中適應性免疫細胞的比例介于22％至31％之間赁豆，先天免疫細胞的比例介于25％至36％之間，非免疫細胞的比例介于32％至62％之間冗美。在上皮細胞中觀察到最高百分比的病毒感染細胞（62％）（圖2 A和1 E）魔种。
高預測感染率并不是由于技術上的人為因素造成的粉洼。首先节预，作者用流式細胞儀證實了感染細胞的高患病率。發(fā)現(xiàn)在感染的肺組織中NP陽性細胞的比例很高属韧，相比之下心铃，當細胞被胞外NP染色時，僅觀察到2%的NP陽性細胞（圖3b）挫剑，表明被感染（NP陽性）細胞的高患病率不能歸因于游離NP蛋白或NP-RNA復合物去扣。其次，觀察到少量的背景噪聲：2075個未暴露細胞中只有25個（1.2%）被錯誤地歸類為受感染細胞（圖2A）樊破。第三愉棱，真正的流感復制涉及從特定片段衍生的vmRNAs剪接亞型的產生。第四哲戚，UMIs與多聚腺苷酸化病毒RNA的3'端特異性對齊奔滑，發(fā)現(xiàn)細胞同時表達不同的病毒基因（圖S1E），證實結果不是非特異性預測的結果顺少。第五朋其，VmRNA的檢測在原理上可以被細胞的質量和復雜性所混淆王浴。
感染細胞的流行是一種細胞類型特異性
在所有主要細胞類型中發(fā)現(xiàn)感染細胞廣泛存在，那不同細胞類型中感染細胞分數(shù)的差異（圖2A）是否反映了真實的生物信號（而不是實驗噪聲）梅猿？為了解決這個問題氓辣，研究者對流感處理動物進行了第二次生物學重復實驗。得到的結果是由相同的細胞類型群體組成袱蚓，共有833個旁觀者和402個感染細胞钞啸。重要的是，被感染細胞的細胞類型特異性百分比在兩個生物學重復中可高度重現(xiàn)（圖2b）喇潘。尤其是T細胞感染率最低体斩，而上皮細胞感染率最高。非免疫細胞感染率普遍高于免疫細胞颖低。值得注意的是絮吵，這些結果在感染后72小時檢查的復制小鼠中是可重復的（原文圖S4A），并且與以前的報告一致（原文圖S4B）忱屑。由于所有的單細胞實驗和計算程序都是獨立地應用于每只小鼠的蹬敲。因此結果表明，在不同細胞類型之間觀察到的感染細胞分數(shù)差異反映了真正的細胞類型特異性想幻。
一種可能解釋這種細胞類型特異性的機制是由主轉錄調節(jié)蛋白Irf7驅動的I型IFN信號傳導。為了測試這種可能性话浇，研究者在感染后48小時從經流感處理的Irf7-KO小鼠生成了肺組織的單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)脏毯。有趣的是，盡管在Irf7-KO和WT小鼠之間觀察到了IFN信號傳導回路的主要差異（原文圖 S1A ）幔崖，但發(fā)現(xiàn)兩種菌株中感染細胞的細胞類型組分之間具有良好的相關性（圖2C）食店。總之赏寇，這些數(shù)據(jù)表明吉嫩，所觀察到的感染百分比差異是由一種或多種細胞類型固有特性引起的，而與I型IFN介導的宿主反應無關嗅定。
感染的上皮細胞顯示出普遍的細胞內病毒載量（而不是其他類型的細胞）
接下來自娩，研究集中于感染細胞亞群中病毒載量的組成。最近的一份報告描述了流感病毒在體外感染上皮細胞的過程中廣泛的病毒載量渠退。研究者想了解這種上皮細胞特性是否也適用于體內感染忙迁。為了解決這個問題，將感染細胞的組分為三類病毒載量狀態(tài)：低（<0.5％）碎乃，中（0.5％和5％之間）和高（> 5％）姊扔。結果發(fā)現(xiàn)上皮細胞表現(xiàn)出兩個數(shù)量級的普遍病毒分布狀態(tài)，33%梅誓、23%和44%的受感染上皮細胞分別以低恰梢、中佛南、高病毒載量狀態(tài)為特征（圖2D）。上皮細胞和其他類型的細胞有明顯的區(qū)別嵌言，通過觀察感染的細胞（非上皮細胞）主要表現(xiàn)為病毒載量狀態(tài)的低異質性：絕大多數(shù)（不同細胞類型中85%-100%的受感染細胞）維持低病毒載量狀態(tài)嗅回，而高病毒載量狀態(tài)僅由高達1.1%的細胞維持（圖2）。表明至少在感染早期呀页，上皮細胞的病毒載量異質性高于其他細胞類型妈拌。
所有細胞類型抗病毒反應的核心特征
研究表明，細胞對流感感染有很強的反應能力蓬蝶，涉及誘導多種干擾素應答基因尘分。為了系統(tǒng)地表征這種反應，研究者分別針對九種細胞類型中的每一種計算了經流感處理的組織和對照組織的細胞群體之間的差異表達丸氛。發(fā)現(xiàn)共有450個基因差異表達（至少在一種細胞類型）培愁。這些基因的聚類顯示了一個由101個基因組成的通用模塊，在流感感染期間幾乎所有免疫和非免疫細胞類型都顯示出一致的上調缓窜。（圖3 A定续，B）。值得注意的是禾锤，該模塊中的大多數(shù)基因代表已知的IFN刺激基因（例如私股，對于“IFNβ1”和“ IFNR”信號類別）和各種抗病毒藥物的靶標轉錄因子如Irf7和Stat1，表明該模塊是獨立于細胞類型的一般I型IFN反應的一部分恩掷。研究者將此通用I型IFN模塊稱為“ IFN模塊”倡鲸。
定義了IFN模塊后，研究者能夠表征每個單個細胞中的抗病毒應答黄娘。通過根據(jù)“抗病毒評分”（根據(jù)IFN模塊中單個細胞的平均表達量計算）排列各個細胞的順序峭状，為每種細胞類型生成抗病毒進展軌跡。該軌跡顯示出強烈的共調節(jié)細胞類型：與之相關的共表達的RANTI基因（圖3c）逼争，軌跡顯示細胞從穩(wěn)態(tài)逐漸發(fā)展到抗病毒狀態(tài)优床。與此一致，流感處理細胞比未暴露細胞更傾向于高抗病毒范圍誓焦。為了驗證抗病毒軌跡胆敞，使用流感處理Irf7 KO小鼠的單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)。假設在沒有Irf7的情況下杂伟，細胞會表現(xiàn)出抗病毒反應的受損軌跡竿秆。發(fā)現(xiàn)Irf7 KO樣本中的細胞確實顯示出對高抗病毒范圍的明顯偏向，但并沒有發(fā)展到完全的抗病毒潛力稿壁。這表明這個軌跡確實反映了細胞通過抗病毒反應的進展幽钢。這種抗病毒軌跡的可塑性可能反映了可逆的調節(jié)變化。
最近的研究表明傅是，線粒體編碼基因響應IFN和脂多糖處理匪燕。然而蕾羊，這些發(fā)現(xiàn)在不同細胞類型中的普遍性及其與流感刺激的相關性仍然未知。有趣的是帽驯，對細胞類型的分析顯示龟再，幾乎所有細胞類型中都有7個線粒體編碼的基因持續(xù)受到抑制（圖3A∧岜洌“線粒體模塊”）利凑。首先捺信，分析了肺部流感處理的大量數(shù)據(jù)擂煞，發(fā)現(xiàn)線粒體模塊受到了抑制明肮。其次识椰，數(shù)據(jù)通過抗病毒細胞軌跡清楚地顯示了干擾素和線粒體模塊的負相關性（圖3D）。進一步檢查三種選定的細胞類型（粒細胞校哎、T細胞和成纖維細胞）表明吏夯，約70%的表達基因通過抗病毒反應軌跡動態(tài)上調或下調静浴。有趣的是磷籍，不同細胞類型的軌跡調控基因富含相同的潛在調控程序适荣，盡管每個調控程序的特定靶基因在不同細胞類型之間存在顯著差異。總的來說院领，數(shù)據(jù)提供了關于哪種基因在特定細胞類型的抗病毒軌跡上受到調控的全面信息弛矛。由于抗病毒動力學的細胞類型特異性目前只知道有限數(shù)量的基因，這種定位對于了解不同細胞類型中抗病毒反應進展的機制至關重要比然。
通用宿主反應與細胞外暴露和細胞內病毒感染有關
感染細胞和旁近細胞中表達變化的高分辨率圖可以傳達有關宿主反應途徑的有價值的信息丈氓。特別地，表達水平的差異可能受到細胞外暴露于感染性肺環(huán)境的影響谈秫，或者可能與細胞內病毒的入侵有關扒寄。先前的研究已經表征了許多在流感感染中起作用的信號級聯(lián)鱼鼓，例如IFN和NF-κB信號拟烫，但每種刺激對宿主反應的貢獻尚不清楚。研究者假設旁近細胞和未暴露細胞群體之間的差異表達將鑒定與暴露于細胞外環(huán)境信號有關的轉錄調控迄本，因為這兩個細胞亞群都缺乏細胞內宿主-病原體的接觸硕淑。同樣，受感染細胞和旁近細胞之間的差異表達可以確定與細胞內病毒感染相關的轉錄調控嘉赎，因為這兩個子集基本上都暴露于相同的細胞外信號置媳。為簡單起見，研究者將旁近細胞/未暴露細胞的差異表達稱為“旁近反應”公条，將感染/旁近細胞的差異表達稱為“感染反應”拇囊。
在所有細胞類型中，通用IFN模塊都顯示出顯著的旁近反應靶橱，表明通用的細胞外暴露效應相比之下寥袭，該模塊的感染反應要小得多路捧，并且在不同細胞類型之間觀察或復制不一致（圖4A-4C）。研究者對感染Irf7 KO小鼠的分析顯示IFN模塊的旁近反應顯著降低（圖4C和4D）传黄。因此杰扫，IFN模塊主要由細胞外暴露以依賴Irf7活性的方式調節(jié)。
線粒體模塊顯示了細胞外暴露和細胞內感染的影響膘掰，除了顯著的旁近反應外章姓，還表現(xiàn)出顯著的感染反應（圖4A和4B）。在所有類型的細胞中识埋，除了上皮細胞外凡伊，與未暴露細胞相比，旁近細胞中的線粒體模塊通常下調惭聂，而受感染細胞群中的抑制作用進一步增強（如圖4B）窗声。Irf7的敲除效應消除了線粒體模塊的旁近反應（如IFN模塊的情況），但對其感染反應沒有實質性影響（圖4C和4D）辜纲。從概念上講笨觅，這表明盡管病毒被維持在相對較低的病毒載量下，但仍可以通過不依賴Irf7的細胞內病毒傳感器進行檢測耕腾。此外见剩，在異步調節(jié)的基礎上，線粒體和IFN程序之間的不耦合：雖然IFN反應的峰值通常是在不存在細胞內浸潤的情況下誘導的扫俺，但線粒體抑制峰值出現(xiàn)在細胞內流感病毒的存在下苍苞。
盡管大多數(shù)細胞類型的旁近細胞表現(xiàn)出線粒體編碼基因的顯著下調，但上皮細胞的旁近細胞表現(xiàn)出相反的趨勢（圖4 D）狼纬。值得注意的是羹呵，細胞內感染逆轉了上皮細胞特異性旁近反應（在整個中/低病毒載量范圍內具有一致的結果），因此所有細胞類型都匯聚到相似的表達水平（圖4 D）疗琉。
盡管研究結果指出了作用于線粒體模塊的兩種不同的旁近機制（誘導上皮細胞和抑制其他細胞類型）冈欢，但與Irf7-KO的發(fā)現(xiàn)進行比較表明，不同細胞類型的差異僅在于兩個基礎程序之間的平衡不同：（1）在上皮細胞中盈简，Irf7-KO旁近細胞中野生型旁近細胞中線粒體模塊的過度表達得以維持（甚至略微升高）（圖4D）凑耻，表明上皮細胞中的調節(jié)是通過不依賴Irf7的強激活和不依賴Irf7的弱抑制實現(xiàn)的。（2）在其余細胞類型中柠贤，野生型的旁近反應與抑制相關香浩，而Irf7-KO的旁近反應顯示出相反的效果（圖4 C， D）臼勉，與組合控制強Irf7介導的抑制和弱Irf7獨立的激活邻吭。通過獨立的生物學重復獲得了相似的結果。
總而言之宴霸，研究表明了作用于所有細胞類型的幾種通用機制囱晴。IFN模塊主要對所有細胞類型中主要由Irf7介導的細胞外暴露做出反應岸裙。相比之下，線粒體模塊受三種不同的通用機制調控：（1）旁近細胞暴露導致Irf7介導的抑制作用（除上皮細胞外速缆，所有細胞類型均受到強烈抑制）降允；（2）旁近細胞暴露導致不依賴Irf7的基因誘導（在上皮細胞中最強）；（3）在所有細胞類型中觀察到的對細胞內病毒侵襲的普遍抑制艺糜。
細胞內病毒感染導致細胞類型特異性反應
檢查某些生物學過程是否顯示細胞類型特異性效應剧董。由于在單個細胞類型中檢測單個基因的統(tǒng)計能力降低，研究者分析了三種細胞類型破停，其中以粒細胞翅楼、T細胞和成纖維細胞為代表的固有細胞、適應性細胞和非免疫細胞數(shù)量最多真慢。在其中一種細胞類型中毅臊，共有234個基因在感染細胞和旁近細胞之間獲得了顯著的差異表達，表明與細胞內病毒感染相關的轉錄反應黑界。為了驗證這些識別基因管嬉，研究者進行了一個使用依賴性生物學重復的實驗結果表明，候選基因與復制小鼠所鑒定的基因有明顯的重疊朗鸠。例如蚯撩，在47只候選者的粒細胞中，17只（36%）在另一只小鼠中獲得顯著分數(shù)烛占。兩個重復之間的差異表達得分也有很強的相關性胎挎。因此，研究者將重點放在34個經驗證的基因上（圖5A）忆家。
對表達模式沿抗病毒軌跡的檢測表明犹菇，所鑒定的靶主要由應答基因組成，在感染的細胞中具有較強的應答幅度(圖5A和5B)芽卿。特別是揭芍，在34個基因中，24個(70%)的旁近細胞和感染反應遵循相同的方向(增強抑制或增強誘導)蹬竖。因此沼沈，細胞內感染通常與細胞型特異性基因的反應高峰有關流酬，而不管反應的方向如何币厕。因此，細胞內感染通常與細胞類型特異基因的反應峰升高有關芽腾，而與反應的方向無關旦装。這并不意外，因為通過Toll樣受體3和RIG-I的細胞內病毒感應可能導致抗病毒反應增強摊滔。
討論
在這項研究中阴绢，研究者使用聚腺苷酸mRNA的單細胞RNA測序來同時研究同一單個細胞中的病毒和宿主轉錄組店乐。本研究中雙重病毒-宿主scRNA-seq定位應廣泛適用于多種病毒。特別是呻袭，定位是針對在細胞內復制過程中產生聚腺苷酸化mRNA的病毒而定制的眨八。scRNA-seq對RNA基因組嵌入未聚腺苷酸化的游離病毒顆粒中的病毒特別有效。該方法應適用于多種醫(yī)學上重要的負義單鏈RNA（ssRNA）病毒（例如RSV左电，流感廉侧，埃博拉和麻疹）和雙鏈DNA病毒（例如皰疹病毒，腺病毒和痘病毒）篓足。將單細胞轉錄組學數(shù)據(jù)與流式細胞儀或大規(guī)模細胞儀（CyTOF）測量相結合可以幫助確定細胞的感染狀態(tài)段誊。但不同病毒基因組片段的表達水平在細胞內可能有顯著差異，這意味著盡管某些細胞大量表達了其他病毒基因栈拖，但某些細胞仍可能顯示出較低的GFP水平连舍。
本研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞確實顯示出高病毒載量異質性，而其余細胞類型則保持低病毒載量狀態(tài)（圖2D）涩哟。值得注意的是索赏，高vmRNA表達并不一定意味著高病毒后代，這可能是由于未能表達一個或多個病毒片段所致贴彼。上皮細胞被認為是流感病毒粒子后代的主要來源参滴，但是相對于細胞內病毒載量狀態(tài)而言，細胞內病毒侵襲的貢獻尚未得到詳細研究锻弓。本研究數(shù)據(jù)表明砾赔，與任何其他細胞類型相比，細胞內病毒狀態(tài)是決定上皮細胞較高病毒后代的主要因素：此處發(fā)現(xiàn)高病毒載量的細胞比例是上皮細胞的30倍（圖2 D）青灼，而被感染的上皮細胞比例僅約1.9倍（圖2 A）暴心。通過分析整個肺部所有細胞類型的流感病毒感染，研究者能夠在所有經過流感處理的肺部所有豐富細胞類型中建立抗病毒誘導和線粒體抑制的一般原理杂拨。表明存在一種有效的抗病毒策略：I型IFN反應的激活提供了抗病毒防御機制专普。
體內流感感染期間線粒體能量資源的抑制可能既有益（限制細胞內病毒復制）又有害（限制宿主快速反應）。因此弹沽，不同的細胞類型可能會在抗病毒反應和線粒體抑制之間保持適當?shù)钠胶馓醇小１狙芯繑?shù)據(jù)表明：（1）通用IFN模塊的異質性通常在旁近細胞中激發(fā)潛力（圖4），并且在細胞內病毒入侵后策橘，抗病毒程序以細胞類型特異性方式進行了微調（圖5）炸渡；（2）線粒體一般性抑制高峰通常出現(xiàn)在受感染的細胞中，并且在沒有細胞內病毒入侵的情況下丽已，旁近細胞表現(xiàn)出線粒體編碼基因的細胞類型特異性調控（上皮細胞上調蚌堵，其余部分則下調）（圖4）。在細胞內病毒入侵之后，當能量資源有限時吼畏，對宿主基因表達的實質性調節(jié)僅限于特定基因和細胞類型督赤。
上皮屏障暴露于入侵的病原體可能先于其他細胞類型。因此泻蚊，上皮細胞維持抗病毒和促炎細胞因子大量分泌的能力對于有效和及時的宿主反應至關重要躲舌。本研究表明上皮細胞在表型上是不同的：旁近細胞上皮細胞顯示出線粒體編碼基因的大量誘導（圖 4C和4D）。確定可以區(qū)分感染細胞和旁近細胞的特定細胞功能是至關重要的性雄。本研究數(shù)據(jù)表明孽糖，線粒體功能性是一個有吸引力的目標，因為觀察到在所有細胞類型中毅贮，線粒體模塊在受感染的細胞中比在旁近血細胞中受到更強烈的抑制（圖4 A）办悟。此外在感染和旁近細胞中差異表達了與流動性和細胞外基質相關的基因（圖5）。確定這種功能差異是否存在以及各種功能之間是否存在相互關系將需要進一步的實驗滩褥。在此類實驗中病蛉，病毒載量和功能特性都需要在單個細胞的分辨率下同時測量。將細胞功能與病毒載量狀態(tài)聯(lián)系起來的能力將有助于感染細胞特異性治療策略的未來發(fā)展瑰煎。
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