《Rixosomal RNA degradation contributes to silencing of Polycomb target genes》

主要結(jié)論：
在體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種新的基因沉默機(jī)制须鼎，該機(jī)制涉及一種含有七個(gè)亞基的蛋白質(zhì)復(fù)合物（被稱之為 Rixosome）對(duì)Nascent RNA 的降解。Polycomb復(fù)合物PRC1通過(guò)蛋白相互作用將Rixosome招募到啟動(dòng)子區(qū)域榛搔。從機(jī)制上講绅作，Rixosome 亞基之一LAS1L是核糖核酸內(nèi)切酶葛躏，它可以切割由 RNA 聚合酶 II 新合成的RNA。切割的 Nascent 可以被另一個(gè) Rixosome 亞基 NOL9 進(jìn)一步磷酸化，它是一種 5'-末端 RNA 激酶奈籽。磷酸化的 5'-末端 RNA 可以被下游因子 XRN2（一種 5'-3' 外切核糖核酸酶）識(shí)別厘惦。XRN2 介導(dǎo)Nascent RNA 的快速和完全降解以及從 DNA 模板中釋放 RNA Pol II偷仿。因此，Rixosome 通過(guò)Nascent RNA 降解和 RNA Pol II 釋放來(lái)阻止基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)绵估，這揭示了教科書(shū)沒(méi)有包括在內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控的新機(jī)制炎疆。（>BioArt）

文獻(xiàn)主要研究思路：
模型為human embryonic kidney (HEK 293FT) cells
1)用3×Flag–NOL9 and 3×Flag–WDR18 做Co-IP，發(fā)現(xiàn)共同有PRC1復(fù)合物成員RING1B国裳，PRC2復(fù)合物成員EZH2形入，暗示rixbosome與H2AK119ub1或H3K27me3等染色質(zhì)修飾相關(guān)；然后通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)證實(shí)rixbosome復(fù)合物的TEX10和PRC1的RING1B是兩個(gè)復(fù)合物互作最重要的中間蛋白缝左。
2)TEX10亿遂、MDN1浓若、RING1B和許多組蛋白修飾的ChIP-seq看它們共同結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)有共同調(diào)控轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)蛇数；之后就是敲基因后再做ChIP-seq看是否會(huì)影響彼此調(diào)控轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)挪钓；結(jié)果證實(shí)確實(shí)它們有共同的基因結(jié)合位點(diǎn)。
3)PRC1大多通過(guò)組蛋白修飾抑制基因轉(zhuǎn)錄耳舅，那rixbosome功能是否參與到PRC1的基因沉默功能碌上？如果有，怎么實(shí)現(xiàn)浦徊？一般這種就是敲復(fù)合物基因后馏予，看共同調(diào)控轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)變化。然后 PRO-seq證實(shí)：rixbosome存在盔性，PRC1調(diào)控位點(diǎn)的基因產(chǎn)生新生RNA少霞丧，這里主要也是在敲基因和回補(bǔ)的細(xì)胞中進(jìn)行比較。
4)然后就是明確rixbosome復(fù)合物降解新生RNA的過(guò)程冕香，主要是從亞基功能出發(fā)蛹尝。

知識(shí)點(diǎn)補(bǔ)充

（1）nascent RNA，新生RNA悉尾，可理解為正在轉(zhuǎn)錄或剛轉(zhuǎn)錄好的RNA突那。

富集nascent RNAs后測(cè)序的方法主要有三種：
(a)Run-on方法是利用一個(gè)限時(shí)脈沖的方法將修飾過(guò)的核糖核酸添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，對(duì)細(xì)胞的RNA進(jìn)行標(biāo)記焕襟；這一過(guò)程可以用使用各種修飾的核苷酸陨收，如全局run-on測(cè)序(Global run-on sequencing, GRO-seq)與精確核酸run-on測(cè)序(Precision nuclear run-on sequencing, PRO-seq)是分別將Bru或生物素修飾的核酸在RNA的轉(zhuǎn)錄期整合到nascent RNA中來(lái)實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)修飾過(guò)的核苷酸整合到RNA后鸵赖，利用抗BrU的抗體务漩，通過(guò)IP的手段將nascent-RNA鏈富集起來(lái)，并用于文庫(kù)制備以及測(cè)序分析它褪。
(b)RNA聚合酶II(Pol II)的IP方法則是利用了微球菌核酸酶(micrococcal nuclease)消化了染色質(zhì)后饵骨，使用相應(yīng)的抗體拉下了與Pol II結(jié)合的RNA。在染色質(zhì)消化過(guò)程中茫打，nascent RNA通過(guò)其Pol II足跡保護(hù)而不受核酸酶活性的影響居触，并不會(huì)被降解。天然延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄測(cè)序(native elongating transcription sequencing, NET-seq)和哺乳動(dòng)物染色質(zhì)天然轉(zhuǎn)錄測(cè)序法(native elongating transcript sequencing for mammalian chromatin, mNET-seq)老赤，
(c)代謝標(biāo)記方法標(biāo)記RNA的方法類似于Run-on方法轮洋，但前者使用的是核苷酸類似物硫代吡啶(4-thiouridine, 4 sU)。提取RNA后抬旺，烷基化4 sU弊予，在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)重中，就會(huì)產(chǎn)生G核苷酸的錯(cuò)配开财，從而通過(guò)在堿基對(duì)級(jí)分辨率的突變分析中直接確定4 sU的整合位點(diǎn)汉柒。這就限制了這種方法的靈敏度误褪。通過(guò)專門針對(duì)RNAs的3’末端（僅最近拉RNA聚合酶的新轉(zhuǎn)錄的RNA）的方法，瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(transient transcriptome sequence, TT-seq)與硫醇(SH, thiol)連接的烷基化RNA代謝測(cè)序(thiol(SH)-linked alkylation for metabolic sequencing of RNA碾褂， SLAM-seq)能夠降低來(lái)源于5’RNA的信號(hào)兽间。

（2）rixosome or RIX1 complex 降解RNA的復(fù)合物；ribosome核糖體

rixosome 復(fù)合物主要成分及功能：含有6個(gè)亞基正塌，an RNA processing complex, composed of Rix1, Crb3, Grc3, Mdn1, Las1 and Ipi 1.This complex, which we propose to name the ‘rixosome’, is conserved from yeast to human, has well-characterized essential functions in ribosomal RNA (rRNA) processing

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