一伞剑、Illumina HumanMethylation450 BeadChip （甲基化450k芯片）簡(jiǎn)介
Illumina最早的甲基化芯片是27K（K代表1000，表示大概可以測(cè)到的CpG位點(diǎn)數(shù)）的數(shù)據(jù)，后來(lái)增加到了450K（主流的甲基化芯片），而目前illumina已經(jīng)出了新一代產(chǎn)品EPIC（我習(xí)慣稱之為850K），但是技術(shù)核心在450K已經(jīng)成熟了渠旁，所以分析流程這里以450K為主（也是目前數(shù)據(jù)庫(kù)主流的甲基化芯片數(shù)據(jù)）。
450K芯片的芯片圖形及其原理可以以下圖（來(lái)源于illumina.com）展示
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1船逮、芯片：一張芯片包括12個(gè)array（如圖顯示）顾腊，也就是一張芯片可以做12個(gè)sample，一臺(tái)機(jī)子一次可以跑8張芯片挖胃，也就是一共96個(gè)sample杂靶，每個(gè)樣本可以測(cè)到超過(guò)450，000個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化信息（大概人所有的1%酱鸭，但是覆蓋了多數(shù)CpG島和啟動(dòng)子區(qū)）伪煤，芯片本身包含一些控制探針可以做質(zhì)控。
2凛辣、原理：簡(jiǎn)而言之抱既，基于亞硫酸鹽處理后的DNA序列雜交的信號(hào)探測(cè)。亞硫酸鹽是甲基化探測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”扁誓，不管是芯片或者甲基化測(cè)序防泵，都要先對(duì)DNA樣品進(jìn)行亞硫酸鹽處理，使非甲基化的C變成U蝗敢，而甲基化的C保持不變捷泞，從而在后續(xù)的測(cè)序或者雜交后區(qū)分出來(lái)。450K采用了兩種探針對(duì)甲基化進(jìn)行測(cè)定寿谴，Infinium I采用了兩種bead（甲基化M和非甲基化U锁右，如圖顯示），而II只有一種bead（即甲基化和非甲基化在一起）讶泰，這也導(dǎo)致了它們?cè)诤罄m(xù)熒光探測(cè)的不同咏瑟，450K采用了兩種熒光探測(cè)信號(hào)（紅光和綠光）。
更多信息可以在官網(wǎng)查看 http://www.illumina.com/products ... _beadchip_kits.html
二痪署、分析需要考慮的問(wèn)題
1码泞、背景校正
2、紅光和綠光的校正
3狼犯、控制芯片的使用（illumina450K本身有一些控制芯片余寥，可以用來(lái)做質(zhì)控领铐，如亞硫酸鹽處理效率）
4、探針類型（I型和II型）的校正（不同探針類型產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不同）
這個(gè)問(wèn)題我們之前關(guān)注很多宋舷，這里附上兩篇文獻(xiàn)供大家參考绪撵，最終我們選擇BMIQ的方法（基于ebayes的原理將II型探針的甲基化水平拉伸到I型水平，如下圖顯示）來(lái)做矯正祝蝠。
文獻(xiàn)1： http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/29/2/189.short
文獻(xiàn)2： http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.4161/epi.24008
圖片來(lái)源于第1篇文獻(xiàn)
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5莲兢、位置的校正（芯片上的不同位置產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可能會(huì)有偏差）
6、批次的校正（不同的批次做的數(shù)據(jù)會(huì)有偏差）
7续膳、探針序列本身是否可靠（有些探針本身位于repeat區(qū)或者包含snp等就會(huì)影響雜交及最后的結(jié)果改艇，應(yīng)該去除，附上一片參考文獻(xiàn)坟岔，里邊有l(wèi)ist可以用來(lái)去除不好的探針）
文獻(xiàn)：http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-15-51
三谒兄、數(shù)據(jù)處理
1、GenomeStudio
GS是illumina開(kāi)發(fā)的軟件社付，基于圖形界面的操作處理承疲，適合于沒(méi)有R及編程基礎(chǔ)的人使用，但是使用GS需要權(quán)限鸥咖，本人試過(guò)挺難破解的燕鸽，如果有人可以破解，可以提供給論壇小伙伴使用啼辣。
2啊研、基于R和bioconductor的pipeline
bioconductor里開(kāi)發(fā)了很多package供大家使用，如果你會(huì)R鸥拧，那么處理這個(gè)甲基化芯片的數(shù)據(jù)將變得簡(jiǎn)單党远。
可以處理450K芯片的package有l(wèi)umi、minfi富弦、wateRmelon沟娱、ChAMP等，沒(méi)有哪一種就特別好腕柜，大家都在不斷改進(jìn)济似，所以只要你知道大概的流程和需要注意的問(wèn)題，那么你也可以自己寫代碼處理盏缤，只是package可以幫你省很多事情砰蠢。下邊我會(huì)附上我的處理流程圖和詳解，還有我的代碼蛾找，我的代碼是基于minfi的娩脾，我再次強(qiáng)調(diào)，代碼只是手段打毛，你可以用其他的package（例如我的同事很多使用ChAMP）柿赊，也許會(huì)更好。
流程圖：
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流程圖詳解：我們一般下載或者iscan后的原始數(shù)據(jù)格式為Idat幻枉，首先可以得到每個(gè)sample的每個(gè)probe的p值和bead數(shù)碰声，根據(jù)p值和bead數(shù)可以進(jìn)行樣本和探針的過(guò)濾，過(guò)濾之后需要用BMIQ的方法進(jìn)行I和II型探針的校正熬甫，矯正之后去掉那些包含snp之類的不好的探針胰挑，最后對(duì)數(shù)據(jù)做batch的校正。校正之后的數(shù)據(jù)就是預(yù)處理后的數(shù)據(jù)了椿肩，可以用于更下游的分析瞻颂，如差異甲基化和甲基化與表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析等。
我的代碼： https://github.com/wkl1990/Illumina450K-methylation郑象，再次強(qiáng)調(diào)贡这，我的代碼并不完美，如果有bug厂榛，請(qǐng)告訴我修改盖矫，構(gòu)建你自己的代碼，讓自己敲起來(lái)击奶。
最后辈双，感謝壇主大神的邀請(qǐng)和鼓勵(lì)，他的學(xué)習(xí)和分享精神一直是我的榜樣柜砾，希望在這里我可以書寫和學(xué)習(xí)更多的知識(shí)湃望，結(jié)識(shí)更多的朋友。
