樣品的照明是在顯微鏡和顯微攝影的關(guān)鍵實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)影像的最重要的變量。科勒照明是由卡爾蔡司公司的奧古斯特·科勒在1893年首次推出為提供最佳的標(biāo)本照明的方法。
由現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室顯微鏡的所有制造商推薦的這種技術(shù)，因?yàn)樗梢援a(chǎn)生標(biāo)本照明即從眩光均勻光亮和無(wú)，從而允許用戶實(shí)現(xiàn)對(duì)顯微鏡的全部潛力厚柳。
制造商已經(jīng)設(shè)計(jì)現(xiàn)代顯微鏡使內(nèi)置在顯微鏡的基座集電極透鏡和任何其它光學(xué)元件將投射燈絲的放大和聚焦的圖像投影到一個(gè)適當(dāng)定位臺(tái)下聚光的孔徑光闌的平面。關(guān)閉或打開(kāi)所述聚光鏡膜片控制所述光線從聚光鏡新興并到達(dá)從所有方位角樣品的角度沐兵。因?yàn)楣庠床痪劢乖跇悠返乃奖鹂澹跈z體水平的光基本上是grainless和擴(kuò)展和聚光鏡的玻璃表面上不會(huì)受到灰塵和瑕疵的惡化。聚光鏡孔徑光闌的開(kāi)閉控制角的光錐到達(dá)樣品扎谎。聚光鏡的孔徑光闌的設(shè)置碳想，與物鏡的口徑一起確定顯微鏡“系統(tǒng)”?實(shí)現(xiàn)的數(shù)值孔徑。作為聚光鏡光圈被打開(kāi)毁靶，在顯微鏡的工作數(shù)值孔徑增大胧奔，產(chǎn)生更大的分辨能力和光透射率。穿過(guò)并照亮樣品平行光線被帶到聚焦在物鏡预吆，其中所述可變電容器孔徑光闌和光源的圖像的圖像將在焦點(diǎn)中可以看出的后焦平面龙填。
在圖1所示的光通路被示意性繪制以表示由檢體照射光射線和成象光線采取不同的路徑。這不是這些途徑的任何實(shí)際偏析的真實(shí)再現(xiàn)，但提出了用于可視化和討論的目的的示意圖岩遗。圖1（a）示出了用于照明光在臺(tái)下聚光器孔徑光闌扇商，物鏡的后焦面的平面產(chǎn)生的燈絲的聚焦圖像的射線路徑，并且視點(diǎn)（也稱為冉斯登盤）目鏡宿礁。是在共同焦點(diǎn)這些區(qū)域通常被稱為共聚面?案铺，這是實(shí)現(xiàn)正確的科勒照明至關(guān)重要。根據(jù)定義窘拯，一個(gè)對(duì)象红且，它是在聚焦在一個(gè)平面上也是焦點(diǎn)在該光路的其他共聚平面。在每個(gè)光通路（包括圖像形成和照明）涤姊，有四個(gè)分開(kāi)的平面，它們一起構(gòu)成了共聚面集合嗤放。
共聚面在科勒照明的照明光（圖1（a））包括的路徑：
燈絲思喊。
聚光鏡孔徑光闌（在聚光鏡的前焦面）。
物鏡的后焦平面次酌。
視點(diǎn)目鏡（也稱為拉姆斯登片）恨课，其位于大約二分之一英寸（一個(gè)厘米）的目鏡的頂端透鏡上面，在那里的觀察者置于觀察時(shí)的眼睛的前部的點(diǎn)岳服。
同樣地剂公，在圖像形成光路中的共聚面中科勒照明（圖1（b））包括：
視場(chǎng)光闌。
聚焦標(biāo)本吊宋。
在中間像平面（即纲辽，目鏡的固定光闌的平面）。
眼睛的視網(wǎng)膜或照相機(jī)的膠片平面璃搜。
共聚焦平面通常在故障排除在光學(xué)元件污染灰塵拖吼，纖維和不完善的顯微鏡是有用的。?如果這些文物是在大家關(guān)注的焦點(diǎn)这吻，因此吊档，它們必須駐留或表面，形成影像集共聚平面的一部分附近唾糯。?該組的成員包括在顯微鏡的光端口玻璃元件怠硼，樣品，在目鏡標(biāo)線片移怯，和目鏡的底部透鏡元件香璃。?另外，如果這些污染物是模糊和失焦芋酌，尋找他們的照明組共享共聚平面元素的附近增显。?這一類嫌疑犯是聚光頂端透鏡（其中灰塵往往積累），暴露的目鏡透鏡元件（從睫毛污染物），和物鏡前透鏡（通常指紋污跡）同云。
圖2示出一個(gè)典型的顯微鏡設(shè)置糖权，其中在燈殼體（照明源）是通過(guò)在顯微鏡基鏡面反射后連接到基座和投射光通過(guò)幾個(gè)透鏡，然后通過(guò)臺(tái)下聚光鏡炸站。光源本身應(yīng)前中心或定心到顯微鏡的光軸星澳。從鎢 - 鹵素?zé)魺艚z發(fā)射的光首先穿過(guò)靠近燈室內(nèi)，然后通過(guò)更接近視場(chǎng)光闌的第二透鏡的集光透鏡旱易。通常禁偎，燒結(jié)或磨砂玻璃濾波器被放置在燈和集電極透鏡漫射光，并確保照明的均勻強(qiáng)度之間阀坏。在實(shí)踐中如暖，燈絲的圖像聚焦到聚光器的前焦面，而在擴(kuò)散玻璃被暫時(shí)從光路中移除忌堂。集電極透鏡的焦距必須小心地匹配于燈絲的尺寸盒至，以確保適當(dāng)大小的一個(gè)燈絲圖象被投影到聚光鏡孔。為適當(dāng)?shù)目评照彰魇啃蓿瑹艚z的圖像應(yīng)完全填滿聚光鏡光圈枷遂。
在光路中的第二透鏡被稱為場(chǎng)透鏡，它負(fù)責(zé)使燈絲的圖像聚焦在臺(tái)下聚光器孔徑光闌的平面棋嘲。聚焦光離開(kāi)場(chǎng)透鏡是通過(guò)視場(chǎng)光闌的反射鏡（定位在45度角的光路）酒唉，并進(jìn)入臺(tái)下聚光反射。視場(chǎng)光闌用作光為顯微鏡的虛擬源及其圖像被聚光到樣品平面聚焦沸移。對(duì)于這些元件的布置的光學(xué)設(shè)計(jì)可以通過(guò)顯微鏡的制造商而變化痪伦，但場(chǎng)光闌應(yīng)在從場(chǎng)透鏡足夠的距離被定位以從在樣品的平面被成像消除灰塵和透鏡的缺陷。
在顯微鏡的基視場(chǎng)光闌只控制的光線到達(dá)聚光鏡束的寬度-它不影響光學(xué)分辨率阔籽，數(shù)值孔徑流妻，或照明的強(qiáng)度。視場(chǎng)光闌的適當(dāng)?shù)恼{(diào)整（即笆制，在光路中心和打開(kāi)以位于外面的視場(chǎng)）是用于防止眩光重要比可以減少所觀察到的圖像中的對(duì)比度绅这。試圖圖像樣本與固有的低對(duì)比度時(shí)過(guò)量的光的消除是特別重要的。當(dāng)視場(chǎng)光闌打開(kāi)太多在辆，從樣品散射的光始發(fā)和反射光從光學(xué)表面傾斜角度可起到降低圖像質(zhì)量证薇。
臺(tái)下聚光鏡通常直接安裝在一個(gè)支架上的顯微鏡載物臺(tái)，可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)滾花旋鈕升高或階段的獨(dú)立地降低匆篓，如在圖2中孔徑光圈被打開(kāi)說(shuō)明和任一擺臂封閉的下方浑度，一桿，或由聚光殼體上旋轉(zhuǎn)的軸環(huán)鸦概。應(yīng)當(dāng)指出的是箩张，臺(tái)下聚光鏡正確調(diào)整可能是實(shí)現(xiàn)正確科勒照明的最關(guān)鍵的方面。?然而不幸的是，聚光鏡偏差和調(diào)整不當(dāng)聚光鏡孔徑光闌的圖像退化和顯微攝影質(zhì)量差的主要來(lái)源先慷。
當(dāng)適當(dāng)調(diào)整饮笛，從聚光鏡的光將通過(guò)投影光錐來(lái)照明視場(chǎng)填補(bǔ)成象光的物鏡的后焦平面（的詳細(xì)討論臺(tái)下聚光鏡被包括在引物的另一部分）。聚光鏡孔徑光闌是負(fù)責(zé)控制照明光錐的角度论熙，因此福青，在數(shù)值孔徑的聚光的。這個(gè)概念在圖3中脓诡，其中的一系列聚光鏡與減小尺寸從左至右在圖中的光錐（和數(shù)值孔徑）示出說(shuō)明无午。聚光光錐形狀也校正所證明在下面的交互式Java教程的光學(xué)像差的程度的函數(shù)：
圖3（a）表示數(shù)值孔徑約1.20，因而具有廣闊的光錐可以與高數(shù)值孔徑物鏡的標(biāo)本攝像裝置的聚光鏡祝谚。?圖3（BD）顯示如何減小孔徑光闌的大小會(huì)產(chǎn)生光錐的尺寸和數(shù)值孔徑（如圖3（b）?NA?= 0.60的相應(yīng)減少;如圖3（c）?的NA?= 0.30;圖3（d?）NA?= 0.15）宪迟。?我們還構(gòu)建了一個(gè)交互式Java教程演示聚光光錐的大小和形狀如何隨數(shù)值孔徑的變化而變化。
要注意踊跟，對(duì)于大小和聚光鏡光錐的形狀是很重要的踩验，這減少了視場(chǎng)光闌的大小僅用于略微減小光錐的在圖3中的角度和數(shù)值示出的下部的尺寸光錐的光圈依然有減少視場(chǎng)光闌的大小基本保持不變。另一個(gè)重要的概念商玫，通常由新手忽視，是照明的強(qiáng)度不應(yīng)通過(guò)開(kāi)閉聚光鏡孔徑光闌牡借，也不是由相對(duì)于軸向移動(dòng)聚光鏡到顯微鏡的光學(xué)中心的控制拳昌。光照強(qiáng)度應(yīng)該只通過(guò)使用放入光路的中性密度過(guò)濾器或通過(guò)降低電壓到燈（盡管后者通常不推薦的，尤其是對(duì)顯微攝影）來(lái)控制钠龙。以確保鎢鹵素?zé)舻淖畲笮阅芫嫣伲傅氖侵圃焐痰膬x器手冊(cè)，以確定最佳的燈電壓（通常為6-10伏特）碴里，并使用該設(shè)置沈矿。照明亮度然后可通過(guò)添加或移除中性密度濾波器來(lái)容易地控制。
臺(tái)下聚光鏡孔徑光闌的尺寸不應(yīng)該只與所需的數(shù)值孔徑一致咬腋，而且所產(chǎn)生的圖像的質(zhì)量應(yīng)予以考慮羹膳。?通常，孔徑光闌應(yīng)調(diào)整根竿，以提供足夠的圖像的對(duì)比度而不被關(guān)閉陵像，以引入分辨率和細(xì)節(jié)的損失的點(diǎn)。?折射率和固有標(biāo)本對(duì)比度是確定孔徑光圈的尺寸非常重要的寇壳。?在一般情況下醒颖，光圈應(yīng)設(shè)置的位置，使整個(gè)光盤大小的60％至90％（在除去目鏡一個(gè)伯特蘭透鏡或后眼管可見(jiàn)）壳炎，雖然這可能與在樣品相反的極端變化泞歉。
上通過(guò)顯微攝影捕獲的圖像的質(zhì)量聚光鏡光圈設(shè)置的影響在圖4中示出的檢體是椴樹(shù)（椴）的薄部干染色用固綠和曙紅，并用40倍平場(chǎng)消色差物鏡上FUJICHROME 64T透明膠片拍攝（NA?= 0.75）和擺動(dòng)出頂級(jí)鏡頭消色差聚光鏡（NA?= 0.90）。?近似聚光鏡光圈開(kāi)口設(shè)置有：如圖4（a） - 90％的（NA?= 0.81）;?如圖4（b） -?60％（NA?= 0.54）;?圖4的（c） -?20％（NA?= 0.18）腰耙。?該組織部分選擇顏色染色透露細(xì)節(jié)和分化子細(xì)胞成分觀察榛丢。
在如圖4（a），其中孔徑光闌被設(shè)置在其中沟优，聚光鏡和物鏡的數(shù)值孔徑是幾乎相等的位置處涕滋，大部分的細(xì)樣品的細(xì)節(jié)是可見(jiàn)的，盡管仍然存在著相當(dāng)量的散射和眩光挠阁。圖象也比其對(duì)應(yīng)宾肺，將其用孔徑光闌的較小設(shè)置所做顯著亮。圖4（b）示出在大約產(chǎn)生的數(shù)值孔徑的70％侵俗，該物鏡的聚光鏡孔徑大小的椴樹(shù)莖锨用。眩光降低，圖像非常清晰隘谣，精細(xì)的圖像細(xì)節(jié)存在不顯著衍射文物增拥。對(duì)于這種樣品，圖4中的顯微照片（b）表示用于聚光鏡孔徑光闌的最佳設(shè)定寻歧。當(dāng)光圈是在物鏡的數(shù)值孔徑為約25％的封閉的最小設(shè)定（圖4（c））掌栅，精細(xì)的圖像細(xì)節(jié)變得模糊不清與衍射偽像和折射現(xiàn)象。圖像也需要對(duì)產(chǎn)生的樣品的顏色色調(diào)的變化較暗整體鑄造码泛。這個(gè)概念可以更詳細(xì)地使用在臺(tái)下互動(dòng)式Java教程探索聚光鏡孔徑光闌?猾封。
從上面的討論很明顯，聚光鏡的孔徑光闌應(yīng)設(shè)置的位置噪珊，將提供依賴晌缘，在相當(dāng)大的程度，對(duì)樣品的吸收痢站，衍射磷箕，以及折射特性直接和偏離的光的折衷混合物。這必須沒(méi)有與文物阵难，晦澀的細(xì)節(jié)和對(duì)比度當(dāng)前錯(cuò)誤增強(qiáng)鋪天蓋地的圖像來(lái)完成岳枷。圖像細(xì)節(jié)和必要，以產(chǎn)生最佳顯微照片對(duì)比度的量還取決于折射率多望，光學(xué)特性和其他檢體相關(guān)的參數(shù)嫩舟。
當(dāng)孔徑光闌被錯(cuò)誤太多閉合，偏離光開(kāi)始模糊直接照射光線怀偷，產(chǎn)生衍射偽像導(dǎo)致可見(jiàn)條紋家厌，帶，和/或在顯微照片圖案形成椎工。其他的問(wèn)題饭于，比如折射現(xiàn)象蜀踏，也可以產(chǎn)生的圖像中的明顯的結(jié)構(gòu)，這是不實(shí)際掰吕」玻或者，打開(kāi)聚光鏡光圈太寬導(dǎo)致從內(nèi)鏡下標(biāo)本和光學(xué)表面多余的眩光和光散射殖熟。這導(dǎo)致對(duì)比度和清洗的顯著損失出的圖像的細(xì)節(jié)局待。正確的設(shè)置將樣品而異標(biāo)本，并且經(jīng)歷顯微鏡將很快學(xué)會(huì)通過(guò)觀察圖像精確調(diào)節(jié)聚光鏡孔徑光闌（和系統(tǒng)的數(shù)值孔徑）菱属，而無(wú)需在物鏡的后焦平面钳榨，以查看振動(dòng)板。事實(shí)上纽门，許多顯微鏡認(rèn)為顯微鏡系統(tǒng)薛耻，以優(yōu)化圖像質(zhì)量的數(shù)值孔徑的臨界還原是在顯微攝影的一個(gè)最重要的步驟。
顯微鏡的照明系統(tǒng)中赏陵，當(dāng)調(diào)整適當(dāng)?shù)目评照彰鞅荩仨殱M足幾個(gè)要求。樣品平面的照射區(qū)域必須至少為視圖對(duì)于任何給定物鏡的數(shù)值孔徑一樣大蝙搔。另外缕溉，光必須是均勻的強(qiáng)度的和數(shù)值孔徑必須從最大值（等于物鏡的）來(lái)表示將取決于樣品的光學(xué)特性的最小值而變化。表1包含物鏡的數(shù)值孔徑與視圖視場(chǎng)（對(duì)于場(chǎng)號(hào)18的目鏡）的每個(gè)物鏡吃型，范圍從非常低到非常高的放大倍率的列表倒淫。
平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)消色差平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡
指定物鏡數(shù)字
光圈查看直徑場(chǎng)
1X0.0418.0
2倍0.069
4倍0.104.50
5倍0.153.60
10倍0.251.80
20倍0.400.90
40倍0.650.45
50倍0.900.36
60X0.950.30
100X1.400.18
表格1
從表1中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，很明顯败玉，鑒于視場(chǎng)直徑的變化是100倍來(lái)自1x 平場(chǎng)消色差到100倍平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡。這產(chǎn)生在1x和100倍的物鏡之間的照明的區(qū)域驚人10,000倍的差異镜硕。這種寬范圍的照明區(qū)域的需要运翼，以適應(yīng)所有的倍率調(diào)整在光路許多組件。這些計(jì)算是在假定18的目鏡場(chǎng)號(hào)兴枯，但許多現(xiàn)代顯微鏡配備有具有20個(gè)或25視圖視場(chǎng)的場(chǎng)數(shù)大視野目鏡（如表1中的三欄給出）可以被重新計(jì)算為任何目鏡使用下面的公式：
D =（FN）/ M
其中D是視場(chǎng)的直徑血淌，F(xiàn)N是目鏡場(chǎng)數(shù)，M是的物鏡放大倍率财剖。
現(xiàn)代顯微鏡配備有具有一個(gè)開(kāi)式透鏡悠夯，其可以從（通過(guò)5倍2倍），用于與低倍率的物鏡用途的光路中移除專門臺(tái)下聚光鏡躺坟。這改變了光路的其余部件的性能沦补，并且一些調(diào)整是必要的，以達(dá)到最佳的照明條件咪橙。視場(chǎng)光闌不能再用于臺(tái)下聚光器的對(duì)準(zhǔn)和居中并且現(xiàn)在是在限制在照明下的樣品的面積是無(wú)效的夕膀。此外虚倒，大部分不希望的眩光一旦通過(guò)視場(chǎng)光闌除去的降低，因?yàn)樵诰酃忡R的頂部透鏡產(chǎn)生具有低得多的數(shù)值孔徑的光錐产舞，允許光線穿過(guò)樣品在低得多的角度通過(guò)魂奥。最重要的是，科勒照明光學(xué)條件不再適用易猫。
顯微鏡的光學(xué)元件和建立科勒照明條件下的走線應(yīng)始終處于較高（10倍）的放大倍率在較低的去除工作外擺式聚光鏡（5倍及以下）的放大倍率前進(jìn)行耻煤。聚光鏡的高度應(yīng)然后不被改變。當(dāng)擺式取下鏡頭准颓，聚光性能徹底改變哈蝇。燈絲的圖像不再形成在孔徑光闌，該停止控制聚光鏡和照明系統(tǒng)的數(shù)值孔徑瞬场。事實(shí)上买鸽，孔徑光闌應(yīng)完全打開(kāi)，以避免漸暈贯被，光在視場(chǎng)的邊緣逐漸褪色眼五。
在低倍率顯微鏡系統(tǒng)為透過(guò)光的改性光通路在圖5中所示的視場(chǎng)光闌現(xiàn)在定位在正確的平面作為孔徑光闌，以控制數(shù)值孔徑的光錐的尺寸和形狀照明和成象光線穿過(guò)聚光鏡彤灶。裝入物鏡看幼，而不是后焦面的檢體平面與等角圓錐（如在科勒照明），但是燈絲現(xiàn)在成像在后透鏡充分照射幌陕。
值得注意的是诵姜，視場(chǎng)光闌的圖像不再形成在樣品平面上，雖然照明的整體強(qiáng)度仍然在視野內(nèi)均勻搏熄，設(shè)置在燈的聚光透鏡稍微擴(kuò)散（化學(xué)蝕刻）或磨砂是很重要棚唆。在低倍顯微鏡視場(chǎng)光闌的新職務(wù)是一個(gè)的話題交互式Java教程的標(biāo)本對(duì)比度調(diào)整在低倍率。
在低倍顯微鏡對(duì)比度調(diào)整用高倍率的物鏡是類似的程序心例，如在圖4所示宵凌。當(dāng)視場(chǎng)光闌是敞開(kāi)的（大于80％），樣品細(xì)節(jié)洗出和散射的一個(gè)顯著量和眩光當(dāng)下止后。閉視場(chǎng)光闌到位置50和80％之間將產(chǎn)生關(guān)于樣品的對(duì)比度和景深的最佳折衷瞎惫。專為低倍率的物鏡是在設(shè)計(jì)上比他們更高的放大倍率同行顯著簡(jiǎn)單。這是由于照明由低倍率聚光鏡译株，其需要較低的數(shù)值孔徑的物鏡產(chǎn)生的光錐的小角度瓜喇。
測(cè)量標(biāo)線片，它必須是在銳聚焦的并疊加在樣品的圖像上歉糜，可以插入到幾個(gè)上面討論的共聚平面乘寒。最常見(jiàn)的目鏡（眼）測(cè)量和顯微攝影掩模版被放置在中間像平面，這是目鏡內(nèi)的固定光闌现恼。這在理論上是可能的也放置掩模版在樣品平面或在照明場(chǎng)膜片的平面肃续。階段微米是專門“掩模版”放置在測(cè)微尺黍檩，其用于校準(zhǔn)目鏡標(biāo)線片，并以使樣品的測(cè)量始锚。放置掩模版中的視場(chǎng)光闌的平面從未做過(guò)（據(jù)我們所知）刽酱，將需要非常高的校正的聚光鏡用于像差完全消除偽像和用于測(cè)量提供鮮明的圖像。
彩色和中性密度濾波器常常放置在光學(xué)路徑中瞧捌，以減少光強(qiáng)度并改變照明的顏色特性棵里。有顯微鏡支架，其中這些過(guò)濾器通常被放置在多個(gè)位置殿怜。一些現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室顯微鏡具有夾在燈殼和集光透鏡头谜，作為對(duì)這些過(guò)濾器的理想位置之間的過(guò)濾器支架。通常情況下笑陈，用色彩校正濾鏡和磨砂擴(kuò)散過(guò)濾器沿著中性密度濾鏡放在一起在這個(gè)過(guò)濾器支架际度。其他顯微鏡的設(shè)計(jì)提供一組內(nèi)部構(gòu)建成可以通過(guò)一個(gè)杠桿裝置被切換到光路徑主體的過(guò)濾器涵妥。為過(guò)濾器的第三公共位置是安裝在臺(tái)下聚光鏡底部乖菱，比孔徑光闌顯著下，將接受的明膠或玻璃過(guò)濾器的保持器蓬网。
不放置過(guò)濾器內(nèi)或附近的任何圖像形成共聚平面的，以避免在過(guò)濾器上的灰塵或表面缺陷與樣品一起待成像是非常重要的。有些顯微鏡對(duì)在該基地將過(guò)濾器附近的光口（近場(chǎng)光闌）的附件。這個(gè)位置可能是太靠近視場(chǎng)光闌，和表面污染可能是在大家關(guān)注的焦點(diǎn)，或出現(xiàn)疊加到圖像模糊偽影婿奔。這也是不明智的直接放在過(guò)濾器在顯微鏡舞臺(tái)出于同樣的原因。
