寫在前面
前述口叙，我已經(jīng)寫了兩個(gè) TBtools 插件澳腹，實(shí)現(xiàn)了在純粹的WIndows環(huán)境下（非虛擬機(jī)，非WSL）巫财，使用 Hisat2 進(jìn)行基因組索引構(gòu)建以及轉(zhuǎn)錄本回帖盗似。最近家里事情較多，期間不少時(shí)間可以天馬行空的想事情平项。過于具體的生物學(xué)問題難以思考出個(gè)答案赫舒，畢竟是以實(shí)踐為主。但數(shù)據(jù)分析上的鬼點(diǎn)子倒是非常合適闽瓢。
過去幾年隶症，正是這類時(shí)間醋界，讓我能設(shè)計(jì)出 TBtools/JIGplot，優(yōu)化出其中各式各樣的特性。正如現(xiàn)在 TBtools 的插件模式儡司，也是臨時(shí)想到的實(shí)現(xiàn)方式拖刃。
今天躺著薯演，突然想著：
- 目的是矯正基因注釋
- 手段是在我改造的基因?yàn)g覽器 IGV-GSAme 矯正
- 輸入是基因組贸诚，待矯正的基因結(jié)構(gòu)注釋以及RNA讀段回帖的BAM
- 操作是基于RNA的Alignments，手動(dòng)調(diào)整注釋
那么問題來了销钝，要在windows完成全部工作有咨，我們會(huì)遇到幾個(gè)問題
- IGV的特性不足，通過 IGV-GSAme 已經(jīng)解決
- 轉(zhuǎn)錄組回帖蒸健，通過 TBtools 的 Hisat2 插件也解決了
- 基因組局部區(qū)域的有參考組裝摔吏，無解!
既然無解，那我完全可以鼓搗一個(gè)windows下的stringTie纵装，中間做個(gè)接口，那么就可以實(shí)現(xiàn)局部組裝（注意据某，指定一個(gè)區(qū)域組裝橡娄，常常反而能組裝出準(zhǔn)確的結(jié)果，具體自行思考）癣籽。千里之行始于足下挽唉，在讓 IGV-GSAme 變得更強(qiáng)之前滤祖，先做一個(gè)簡單的東西，TBtools插件瓶籽。
StringTie Wrapper - 新的 TBtools 插件
一共兩個(gè)對應(yīng)的是 Stringtie 兩個(gè)主要功能：
- Stringtie Assembly : 轉(zhuǎn)錄組組裝
- Stringtie Quantify : 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量估計(jì)
StringTie Assembly 插件的使用
對于組裝一步匠童，參數(shù)簡單，用戶只需要提供排序好的BAM文件即可塑顺，這些文件汤求，事實(shí)上可以通過前幾天推的 Hisat-build 和 Hisat-align 插件來獲取。需要注意的有三點(diǎn)：
- 參考物種基因結(jié)構(gòu)注釋是可選的
- 設(shè)置輸出目錄而不是輸出文件严拒，因?yàn)榻M裝時(shí)是單個(gè)bam文件單獨(dú)組裝扬绪，最后再進(jìn)行一次merge，得到最終可用的 GTF 文件（具體Fasta序列提取裤唠，可直接使用 TBtools 的 GXF Sequence Extract挤牛，請參考公號(hào)前述推文）
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并行線程數(shù)，應(yīng)該注意种蘸，此處的并行線程數(shù)與Stringtie軟件的線程數(shù)并不等價(jià)墓赴。（我調(diào)整了stringtie源碼，編譯并使其可以在windows下運(yùn)行航瞭，但windows系統(tǒng)限制诫硕，所以只能單線程，且速度上不來沧奴。這沒關(guān)系痘括，我們可以多個(gè)文件同時(shí)組裝，這樣也就只需要使用stringtie的單線程模式滔吠，畢竟很多時(shí)候纲菌，我們并不可能做一個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測序和組裝 - PS：windows下可能會(huì)慢不少，比如6G的轉(zhuǎn)錄組疮绷，估計(jì)組裝時(shí)間大概要到 1個(gè)小時(shí)翰舌，在我的筆記本上。不過同時(shí)跑2個(gè)冬骚，那么也是1個(gè)小時(shí)嘛..）
組裝結(jié)果大體如下椅贱，我做了兩個(gè)實(shí)際數(shù)據(jù)的，
StringTie Quantify 插件的使用
使用簡單只冻，用戶需要的注意的幾乎只有三點(diǎn)：
- 排序好的BAM文件
- 一個(gè)必須的基因結(jié)構(gòu)注釋文件庇麦，可以是gff3也可以是gtf，比如使用 StringTie Assembly插件整理的組裝結(jié)果喜德。
- ReadLength, 這一參數(shù)即測序讀長山橄。因?yàn)镾tringTie計(jì)算的其實(shí)是Coverage，并沒有讀段計(jì)數(shù)這一步舍悯。常見的操作是簡單地基于Coverage反推raw counts航棱。于是read length成為必要睡雇。
整體上會(huì)輸出六個(gè)矩陣，具體大伙自己看名字就知道是啥饮醇。
即它抱，轉(zhuǎn)錄本水平或基因水平的Counts，F(xiàn)PKM朴艰，TPM矩陣观蓄。可查看其中某個(gè)呵晚。
注意到蜘腌，我前面做StringTie Assembly的時(shí)候設(shè)置了參考注釋，所以AcoXXXX等ID為原始注釋ID（事實(shí)上是沒有被組裝出來的饵隙，一般是覆蓋率極低）撮珠，而MSTRGXXXX等為已有注釋中被當(dāng)前樣品覆蓋以及新注釋出來的基因。
PS：四個(gè)插件將會(huì)一并上線至插件商店金矛，暫時(shí)票價(jià)應(yīng)該會(huì)定位 100芯急，打包估計(jì) 365，具體再定驶俊。
感興趣的娶耍，想上車的，請參考前述《Plugin | 高速版插件商店饼酿！我又有一個(gè)絕妙的 idea》推文榕酒。
寫在最后
現(xiàn)在是大年三十晚上九點(diǎn)，也算是在新春到來之時(shí)故俐，了卻一個(gè)鬼點(diǎn)子想鹰。
在此祝大伙新春快樂，牛年大吉药版！
