Single-Cell Transcriptional Profiling Reveals Cellular Diversity and Intercommunication in the Mouse Heart
摘要：
心臟細(xì)胞組（形成心臟的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)）的特征對于理解心臟發(fā)育和正常器官功能以及制定精確的治療策略以對抗心臟病至關(guān)重要。最近的研究重塑了對心臟細(xì)胞組成的理解体斩，并強(qiáng)調(diào)了非心肌細(xì)胞類型的重要功能作用梭稚。在這項研究中，作者使用scRNA-seq表征了小鼠非心肌細(xì)胞心臟細(xì)胞景觀的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜絮吵，揭示了心臟細(xì)胞組的多樣性弧烤，并促進(jìn)了分離未研究的心臟細(xì)胞群（如壁細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞）的技術(shù)發(fā)展。該研究還揭示了廣泛的細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)蹬敲，并表明心臟基因表達(dá)中普遍存在性別二型性暇昂。這項研究為哺乳動物心臟細(xì)胞組的結(jié)構(gòu)和功能提供了見解，并為促進(jìn)心臟細(xì)胞生物學(xué)研究提供了重要資源伴嗡。
為了獲得非肌細(xì)胞心臟細(xì)胞組的高分辨率圖譜急波，從雌性和雄性小鼠的心室中制備了活的、代謝活性的瘪校、有核的非肌細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液澄暮，用于scRNA-seq分析。為了盡量減少由于酶消化和細(xì)胞分選而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄譜的任何潛在變化阱扬，選擇了一種解離培養(yǎng)時間相對較短的方案泣懊，并在所有后續(xù)步驟中保持細(xì)胞懸浮液在冰上（實(shí)驗(yàn)程序）。為了避免內(nèi)皮細(xì)胞的過度采樣麻惶，將內(nèi)皮細(xì)胞的比例降低到占非肌細(xì)胞總數(shù)的10%（圖1A）使用10x Chromium平臺獲得了單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜馍刮，并分析了10519個通過質(zhì)量控制和篩選的細(xì)胞，其中每個細(xì)胞平均測量了1897個基因窃蹋。
為了基于共享和獨(dú)特的基因表達(dá)模式識別不同的細(xì)胞群體卡啰，使用Seurat軟件進(jìn)行了降維和無監(jiān)督細(xì)胞聚類。鑒定了12個表達(dá)主要細(xì)胞類型已知標(biāo)記物的不同細(xì)胞簇（圖1B和1C警没；包括內(nèi)皮細(xì)胞（Cdh5匈辱，Pecam1），成纖維細(xì)胞（2簇杀迹；Cola1亡脸，Pdgfra，Tcf21），粒細(xì)胞（Ccr1梗掰，Csf3r嵌言，S100a9），淋巴細(xì)胞（3簇及穗；Ms4a1摧茴、Cd3e、Klrb1c埂陆、Ncr1）苛白，周細(xì)胞（P2ry14、Pdgfrb）焚虱，巨噬細(xì)胞（Adgre1购裙、Fcgr1），樹突狀細(xì)胞（DC）樣細(xì)胞（Cd209a）鹃栽，雪旺細(xì)胞（Plp1躏率、Cnp），平滑肌細(xì)胞（SMC民鼓；Acta2薇芝，Tagln）。定義細(xì)胞群的原型標(biāo)志物（圖1C）包括Col1a1（成纖維細(xì)胞）丰嘉、Ms4a1（B淋巴細(xì)胞）夯到、Plp1（雪旺細(xì)胞）和Acta2（SMC）。還發(fā)現(xiàn)了其他基因并特別標(biāo)記了每個主要細(xì)胞群（圖1D）饮亏。每個主要聚類中表達(dá)受限的基因的GO富集分析支持細(xì)胞群的預(yù)測身份耍贾。例如，成纖維細(xì)胞的特異性由與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的術(shù)語驅(qū)動路幸；白細(xì)胞與免疫調(diào)節(jié)術(shù)語相關(guān)荐开；髂內(nèi)細(xì)胞和SMC與血管發(fā)育和穩(wěn)態(tài)相關(guān)；雪旺細(xì)胞與神經(jīng)調(diào)節(jié)因子有關(guān)劝赔。
為了揭示主要細(xì)胞類型的異質(zhì)性誓焦，對這些群體進(jìn)行了亞分群（圖2A胆敞；圖S1B和S1C）着帽。使用了類似的無監(jiān)督方法，如所述并分析單個類型或多個相關(guān)類型的細(xì)胞（例如髓系或淋巴系白細(xì)胞）以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞亞型移层。對于一些細(xì)胞群仍翰，如內(nèi)皮細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和SMC观话，亞聚類沒有識別出轉(zhuǎn)錄上不同的亞群（圖2B）予借，這表明這些細(xì)胞群在成熟心臟中相對均勻。相比之下，在其他細(xì)胞群體中出現(xiàn)了多水平的亞群異質(zhì)性灵迫，其中亞群清晰而明顯地分離了可識別的群體秦叛。例如，淋巴細(xì)胞群的亞群顯示瀑粥，第2組先天性淋巴細(xì)胞群（ILC2s挣跋；Artis和Spits）表達(dá)Gata3、Areg和Rora等基因狞换，這些基因以前與T淋巴細(xì)胞聚集在一起（圖1B避咆、2A和2B）。此外修噪，僅T淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步亞群產(chǎn)生了2個對應(yīng)于CD4+和CD8+T細(xì)胞的群（圖2A）查库。在一些主要的集群中，分化亞群的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性反映了連續(xù)梯度黄琼，而不是具有明確基因表達(dá)邊界的均質(zhì)細(xì)胞的離散組樊销。例如，將所有髓系群體一起進(jìn)行亞聚類脏款，確定了在整體水平上檢測到的粒細(xì)胞群體（圖1B和1C）现柠，但巨噬細(xì)胞和DC樣亞型不太清楚地分離，并通過轉(zhuǎn)錄梯度連接（圖2A–2C弛矛；圖S2）够吩。與基于標(biāo)記物（如Cx3cr1、H2-Aa/Ab（主要組織相容性復(fù)合體[MHC]II類）丈氓、Ccr2周循、Mrc1和Adgre1）的心臟組織巨噬細(xì)胞的典型亞型相比，這呈現(xiàn)了更為細(xì)微的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄景觀圖万俗。根據(jù)幾個基因組合表達(dá)的細(xì)微差異湾笛，至少可以將巨噬細(xì)胞分為五種亞型（圖2A–2C），在某些情況下闰歪，在進(jìn)一步的亞聚類后可以發(fā)現(xiàn)額外的髓系亞群嚎研。
在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一個細(xì)胞亞群，表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的雜交分子特征库倘，類似于假定的纖維細(xì)胞群临扮。這些細(xì)胞表達(dá)對應(yīng)于成纖維細(xì)胞（Col1a1、Pdgfra和Tcf21）和巨噬細(xì)胞/白細(xì)胞（Fcgr1教翩、Cd14和Ptprc）的中等水平的典型基因（圖2D）杆勇。通過檢測PDGFRaGFP/+小鼠心臟中的GFP+白細(xì)胞（圖2E），并使用ImageStream細(xì)胞術(shù)捕獲攜帶巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的GFP+單細(xì)胞圖像（圖2F）饱亿，確認(rèn)了假定纖維細(xì)胞的存在蚜退。還檢測到在其他幾個主要細(xì)胞群中表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣基因特征的小細(xì)胞亞群（圖2G）闰靴，這些亞群似乎是真實(shí)的。例如钻注，觀察到Icam2+內(nèi)皮細(xì)胞顯示成纖維細(xì)胞樣基因表達(dá)蚂且，用表達(dá)Icam2的GFP+單細(xì)胞的細(xì)胞計數(shù)圖像證實(shí)了這一點(diǎn)（圖S3E）。雜交間充質(zhì)表型的表達(dá)可能是廣泛細(xì)胞類型的固有特征幅恋。
在本分析中確定的主要心臟細(xì)胞群中膘掰，已知心臟細(xì)胞群的顯著缺失包括以Tbx18標(biāo)記的心外膜細(xì)胞，其表達(dá)分散在成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞簇內(nèi)的細(xì)胞中佳遣。標(biāo)記推定心臟祖細(xì)胞的Isl1轉(zhuǎn)錄物存在于4個細(xì)胞中识埋，但這些轉(zhuǎn)錄物分散在不同的心臟細(xì)胞群中，并沒有形成明顯的簇零渐。表達(dá)Prox1和Pdpn的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞也不存在于人工減少的內(nèi)皮細(xì)胞群中窒舟，但這些細(xì)胞通常只包括占非肌細(xì)胞總數(shù)的3%。也沒有檢測到離散的單核細(xì)胞群诵盼，這些單核細(xì)胞以低頻率存在惠豺，很可能分散在巨噬細(xì)胞簇中》缒總的來說洁墙，這些細(xì)胞群的缺失可能是因?yàn)樗鼈兊呢S度相對較低，并且缺乏高度獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征戒财。
Cspg4和Mcam在壁細(xì)胞和雪旺細(xì)胞中表達(dá)热监，Pdgfrb在壁細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中表達(dá)（圖3A）。ITGA7染色后對常駐間充質(zhì)細(xì)胞（RMC饮寞；圖S3A）的檢查使壁細(xì)胞能夠使用mEF-SK4 作為次要標(biāo)記物與成纖維細(xì)胞區(qū)分開來孝扛。該方法鑒定了3個群體：R1（mEF-SK4hiITGA7？）幽崩，R2（mEF-SK4int/loITGA7+）和R3（mEF-SK4loITGA7苦始？）（圖3C）。對分別在成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞中標(biāo)記表達(dá)的PDGFRaGFP和CSPG4-GFP小鼠的分析（圖3B–D）表明慌申，PDGFRaGFP/+小鼠心臟中幾乎所有的GFP+RMC都在R1內(nèi)陌选，而CSPG4-GFP小鼠心臟中的幾乎所有GFP+rmC都在R2內(nèi)（圖3D）。相反蹄溉，對R1–3中GFP+細(xì)胞的分析表明咨油，在PDGFRaGFP小鼠心臟中，幾乎所有R1細(xì)胞都是GFP+类缤，而在CSPG4-GFP小鼠中臼勉，大多數(shù)R2細(xì)胞都是GFP+（圖3C）邻吭。因此餐弱，可以使用mEF-SK4和ITGA7標(biāo)記物高精度地鑒定和分離心臟成纖維細(xì)胞（此處定義為PDGFRa+細(xì)胞），其中ITGA7將壁細(xì)胞與mEF-SK4低/點(diǎn)成纖維細(xì)胞區(qū)分開來。與ITGA7相似膏蚓，發(fā)現(xiàn)MCAM將壁細(xì)胞與成纖維細(xì)胞分離瓢谢，但也標(biāo)記了雪旺細(xì)胞。此外驮瞧，驗(yàn)證了ENTPD1, CD59a分別識別SMC和雪旺細(xì)胞（圖S3C和S3D）氓扛。通過結(jié)合這些標(biāo)記物，能夠識別和分離SMC论笔、周細(xì)胞和雪旺細(xì)胞（圖3E和3F）采郎。
在心臟非肌細(xì)胞中檢測到同源受體的廣播配體（圖4A）確定成纖維細(xì)胞是與多種細(xì)胞類型緊密連接的最營養(yǎng)的細(xì)胞群（圖4B）。其中包括支持特定心臟細(xì)胞群存活的信號電路（圖4C）狂魔。例如蒜埋，成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞分別表達(dá)Csf1和Il34（圖4D），它們通過CSF1R發(fā)出信號最楷，是巨噬細(xì)胞生長和存活的重要因素整份。成纖維細(xì)胞還表達(dá)生長因子Ngf、Vegfa籽孙、Igf1烈评、a n d Fgf2（圖4C），它們支持自主神經(jīng)系統(tǒng)犯建、內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞的神經(jīng)元讲冠。
為了檢測心臟細(xì)胞在心臟細(xì)胞組內(nèi)支持細(xì)胞類型的能力，培養(yǎng)了混合的心臟細(xì)胞适瓦，并在體外觀察了不同細(xì)胞群的生長沟启。LysM-Cre:RosaZsGreen/+小鼠的非肌細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生了大量由ZsGreen熒光蛋白標(biāo)記的巨噬細(xì)胞（圖4E和4F）以及內(nèi)皮細(xì)胞（圖4G）。然而犹菇，當(dāng)用CSF1R阻斷抗體德迹、合成CSF1R抑制劑GW2580處理培養(yǎng)物時，或當(dāng)在沒有非巨噬細(xì)胞的正常生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)時揭芍，巨噬細(xì)胞無法生長胳搞。盡管這些結(jié)果表明成纖維細(xì)胞支持心臟巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長，但非成纖維細(xì)胞來源的必需生長因子表明了建立心臟生態(tài)位和支持常駐細(xì)胞群的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性称杨。分析還表明肌毅，不同的細(xì)胞群支持心臟的神經(jīng)支配。壁細(xì)胞表達(dá)Ngf和Ntf3姑原，這兩種都是軸突發(fā)育的重要因素（圖4C）悬而。心臟周細(xì)胞Ngf和Ntf3的表達(dá)突顯了它們在心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的潛在重要作用。此外锭汛，心臟雪旺細(xì)胞（外周神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘生成細(xì)胞）是一個離散的心臟細(xì)胞群笨奠。因此袭蝗，多種心臟細(xì)胞類型有助于支持自主神經(jīng)的發(fā)育、維持和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)般婆。
為了調(diào)查心臟非肌細(xì)胞基因表達(dá)中的性別二型性到腥，根據(jù)女性（Xist）和男性特異性基因的表達(dá)分離了女性和男性細(xì)胞（6個Y染色體基因：Ddx3y、Eif2s3y蔚袍、Erdr1乡范、Gm29650、Kdm5d和Uty啤咽；圖5A）晋辆。在整體水平上觀察到雌性和雄性細(xì)胞的高度相似的聚類模式，但在單個細(xì)胞類型中宇整，發(fā)現(xiàn)了許多基因在表達(dá)中表現(xiàn)出性別二型性（圖5A）栈拖。在女性細(xì)胞中上調(diào)的396個基因和男性中上調(diào)的430個基因中，絕大多數(shù)的差異表達(dá)低于2倍（圖5B）没陡，女性和男性的中位差異為1.17倍涩哟。由于基于每種性別的2個生物復(fù)制的比較，分析能力不足盼玄，但這些發(fā)現(xiàn)提供了一個機(jī)會來表征轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中廣泛的性別依賴性變化贴彼，并識別候選的性別二型基因“６基因表達(dá)中的性二形性的具體機(jī)制可能多種多樣器仗，包括細(xì)胞亞型組成的細(xì)微變化以及對激素提示或反式性染色體因子的調(diào)節(jié)反應(yīng)。對每個細(xì)胞群體中最高度的性二型基因的分析提供了證據(jù)童番，證明基因表達(dá)中性二型的程度和方向依賴于細(xì)胞類型（圖5C精钮；表S5）。此外剃斧，鑒定了27個基因轨香，這些基因在細(xì)胞類型之間表現(xiàn)出不一致的性二型表達(dá)模式（圖5D），揭示了生物性別對心臟基因表達(dá)的二分法效應(yīng)幼东。在男性巨噬細(xì)胞中臂容，發(fā)現(xiàn)男性上調(diào)基因往往在對外來抗原的反應(yīng)中發(fā)揮作用，GO顯著富集根蟹，包括通過MHC II類分子的抗原處理和呈遞脓杉，以及更廣泛的免疫反應(yīng)（調(diào)整后p<0.001）。相反简逮，巨噬細(xì)胞中的雌性上調(diào)基因在涉及應(yīng)激反應(yīng)和電子傳輸鏈的過程中富集球散。心臟組織巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜中的性二形性，如男性上調(diào)Irf8散庶，這與慢性炎癥有關(guān)蕉堰。相反凌净，女性巨噬細(xì)胞中最上調(diào)的基因和兩性巨噬細(xì)胞中最具性二態(tài)性的基因（圖5C）是Tsc22d3（也稱為Gilz），這是一種與抗炎功能有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子嘁灯，也是糖皮質(zhì)激素有效抗炎作用的下游驅(qū)動因素泻蚊。Tsc22d3過表達(dá)會抑制炎癥并減少心肌細(xì)胞死亡躲舌。然而丑婿，巨噬細(xì)胞Tsc22d3的表達(dá)不太可能單獨(dú)賦予女性心臟抗炎表型，女性心臟也具有與抗炎機(jī)制有關(guān)的其他基因的表達(dá)升高没卸，如Cebpb（圖5C）羹奉。
這項研究建立在先前對心臟細(xì)胞多樣性的探索基礎(chǔ)上，并為心臟細(xì)胞組的結(jié)構(gòu)和功能提供了獨(dú)特見解约计，表征了小鼠心臟內(nèi)主要非心肌細(xì)胞群的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜诀拭。觀察到密集的配體受體網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)了不同細(xì)胞類型之間的廣泛溝通，并記錄了生物性別對控制器官功能的轉(zhuǎn)錄程序的貢獻(xiàn)煤蚌。
使用scRNA-seq數(shù)據(jù)集開發(fā)了使用流式細(xì)胞術(shù)更精確地識別心臟壁細(xì)胞耕挨、成纖維細(xì)胞和雪旺細(xì)胞的策略。
總結(jié)的點(diǎn)：
1.識別了多種非心肌細(xì)胞的類型尉桩，并在淋巴細(xì)胞筒占，巨噬細(xì)胞中分出了一些細(xì)胞亞群；在巨噬細(xì)胞中蜘犁，有一種細(xì)胞亞群既有巨噬細(xì)胞的特征翰苫，也有成纖維細(xì)胞的特征。
2.使用mEF-SK4和ITGA7標(biāo)記物高精度地鑒定和分離心臟成纖維細(xì)胞（此處定義為PDGFRa+細(xì)胞）这橙，其中ITGA7將壁細(xì)胞與mEF-SK4低/點(diǎn)成纖維細(xì)胞區(qū)分開來奏窑。
3.細(xì)胞通訊分析發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞是與多種細(xì)胞類型緊密連接的最營養(yǎng)的細(xì)胞群，其中包括支持特定心臟細(xì)胞群存活的信號電路。成纖維細(xì)胞還表達(dá)生長因子Ngf糙置、Vegfa懂诗、Igf1、a n d Fgf2筑凫，它們支持自主神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞的神經(jīng)元并村。
