Nature Biotechnology | 魏文勝課題組再次報(bào)道長(zhǎng)非編碼RNA的功能性篩選新方法
2018年11月5日陋桂，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了題為“Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites”的研究論文宣渗。
作為強(qiáng)大的基因編輯工具梨州，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在蛋白編碼基因的外顯子區(qū)域產(chǎn)生移碼突變而徹底破壞蛋白表達(dá)及功能，這一特性被廣泛應(yīng)用于基因的大規(guī)模功能性篩選研究摊唇。人類基因組中除了蛋白編碼基因，絕大多數(shù)區(qū)域?yàn)榉蔷幋a序列有序。其中長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）已有上萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)被注釋岛请，但是它們絕大多數(shù)功能未知，一些已知功能的lncRNA與癌癥等很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)盅称。
魏文勝課題組與合作者之前率先建立了通過成對(duì)gRNA（pgRNA）在基因組中產(chǎn)生大片段刪除的策略來對(duì)lncRNA進(jìn)行高通量功能性篩選（Zhu et al. Nature Biotechnol 2016）。后續(xù)又有報(bào)道通過CRISPRi（Liu et al. Science 2017）以及CRISPRa（Joung et al. Nature 2017）等方法來進(jìn)行l(wèi)ncRNA的高通量功能性篩選缩膝。這些方法在效率混狠、質(zhì)量（假陽(yáng)性、假陰性）上各有欠缺：比如CRISPRi的方法只能實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)抑制而不是完全敲除疾层，CRISPRa的方法只能上調(diào)基因表達(dá)将饺，無(wú)法對(duì)基因不可或缺的作用實(shí)施篩選評(píng)估。大片段刪除的策略由于步驟的繁瑣痛黎，也限制了其在更大規(guī)模上得到應(yīng)用予弧。
為了突破以上方法上的局限，魏文勝研究組設(shè)計(jì)了新的篩選策略湖饱，構(gòu)建了特異性靶向基因的剪接位點(diǎn)的新型CRISPR文庫(kù)掖蛤，以高通量的方式產(chǎn)生基因的外顯子缺失或者內(nèi)含子滯留。運(yùn)用這一策略井厌，實(shí)現(xiàn)了全基因組水平上對(duì)于lncRNA功能的高效篩選蚓庭。利用靶向10,996個(gè) lncRNA的特殊CRISPR文庫(kù)仅仆，在慢性髓性白血病細(xì)胞K562中篩選并發(fā)現(xiàn)了230個(gè) lncRNA與細(xì)胞存活或增殖相關(guān)彪置。在HeLa細(xì)胞以及人B淋巴細(xì)胞GM12878中則分別發(fā)現(xiàn)了115個(gè)及220個(gè)影響細(xì)胞存活與增殖的lncRNA。進(jìn)一步分析表明蝇恶，lncRNA功能在不同細(xì)胞種類中具有顯著異質(zhì)性。這一新型高通量技術(shù)平臺(tái)的建立惶桐，首次真正實(shí)現(xiàn)了從全基因組水平對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA進(jìn)行基于完全敲除的高通量篩選撮弧，該方法學(xué)將為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和解析lncRNA功能提供有效的工具。
(a) 真核生物（人）剪接位點(diǎn)區(qū)域的基因組序列特征和堿基特異性姚糊。(b) 靶向剪接位點(diǎn)的長(zhǎng)非編碼RNA的功能性篩選策略贿衍。(c) K562細(xì)胞中影響細(xì)胞存活與增殖的lncRNA篩選結(jié)果。
救恨。
