? ? ? ? 自從孟德爾用不同表型的豌豆品種進(jìn)行雜交試驗以探討生物的遺傳規(guī)律以來，一部遺傳學(xué)的發(fā)展史反映了人類對基因不斷深化認(rèn)識的過程夭拌。特別在分子遺傳學(xué)誕生以后魔熏，有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、突變鸽扁、表達(dá)蒜绽、調(diào)節(jié)與克隆等方面的研究取得很大的進(jìn)展。這不但幫助生物學(xué)各分支學(xué)科找到了深化自己研究問題的思路桶现，同時也為解決醫(yī)藥與農(nóng)業(yè)上的許多難題提供了新的技術(shù)與途徑躲雅。但是目前對基因仍有許多不夠了解的地方，還有許多基因尚未被克隆骡和。這有待不同學(xué)科研究者的共同努力來完成相赁。下面就近年有關(guān)植物中編碼蛋白質(zhì)的核基因的結(jié)構(gòu)，以及表達(dá)調(diào)控方面的一些進(jìn)展作一簡單的介紹慰于。
? ? ? ? 本推文分兩個部分介紹钮科，第一部分為基因的結(jié)構(gòu)，第二部分為基因的表達(dá)調(diào)控婆赠，每一部分又分一小章節(jié)進(jìn)行介紹绵脯，以下是內(nèi)容目錄。
?一. 基因的結(jié)構(gòu)
?1.1休里、5’上游區(qū)
?1.2蛆挫、5’非翻譯區(qū)
?1.3、編碼區(qū)
?1.4份帐、3’非翻譯區(qū)
?二. 基因的表達(dá)調(diào)控
?2.1璃吧、器官與組織專一性表達(dá)的基因
?2.2楣导、受環(huán)境因素誘導(dǎo)而表達(dá)的基因
?2.3废境、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)理
克隆植物中核基因的方法
?在研究一個基因的結(jié)構(gòu)之前，先要克隆到這個基因。目前常用來克隆植物中編碼蛋白質(zhì)的核基因的方法大致有以下幾種：
a.序列克仑肌巴元；b. 依據(jù)序列同源性克隆基因；c. 人工合成并克隆基因驮宴；d. 表型克隆 逮刨；e. 功能克隆
f. 定位克隆 ；g. 轉(zhuǎn)座子標(biāo)記法
a . 序列克露略蟆：
? ? 根據(jù)已知基因的序列設(shè)計并合成一對引物修己，從植物中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段經(jīng)純化后通過TA克隆連接到合適的載體上迎罗，測序睬愤，并與已知基因序列進(jìn)行比較。
b . 依據(jù)序列同源性克隆基因 ：
? ? 在其它種屬的同源基因已被克隆的前提下纹安，構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫尤辱，然后以已知的基因序列（序列片段）作為探針來篩選目的克隆。
例子：根據(jù)甜菜堿醛脫氫酶基因序列克隆菠菜堿醛脫氫酶基因厢岂、自交不親和 基因光督、花形態(tài)建成基因。
c . 人工合成并克隆基因
? ? ? 根據(jù)已知的氨基酸或核苷酸序列塔粒，采用植物偏愛的密碼子结借，人工合成并克隆該基因。（可對基因進(jìn)行改造）
d. 表型克伦洳纭：
? ? ? 利用植物的表型差異或組織器官特異表達(dá)產(chǎn)生的差異來克隆植物基因映跟。此方法試圖把表型與基因結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)聯(lián)系起來，從而分離特定表型相關(guān)基因扬虚。不必事先知道基因的生化功能或圖譜定位努隙，根據(jù)基因的表達(dá)效應(yīng)就直接分離該基因。
例子：利用表型差異從擬南芥中克隆出赤霉素合成酶基因辜昵。
e. 功能克隆
? ? 根據(jù)性狀的基本生化特性這一功能信息荸镊，在鑒定和已知基因的功能后克隆。方法：純化相應(yīng)的編碼蛋白→構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫→篩選基因堪置。特點：用基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白質(zhì)來克隆基因躬存。
此方法有兩種
Ⅰ.根據(jù)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)
? ? ? 首先將純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸測序，推測可能的mRNA序列舀锨，據(jù)此合成寡核苷酸探針從文庫中篩選編碼基因岭洲。然后將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng)的抗體探針，從文庫中篩選相應(yīng)基因并克隆坎匿。最后根據(jù)mRNA序列設(shè)計相應(yīng)的寡核苷酸引物,對核DNA或cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增盾剩。
Ⅱ.根據(jù)基因的表型突變互補功能
? ? ? 植物的許多基因與細(xì)菌或酵母的突變體互補雷激。 如擬南芥的cDNA文庫可與酵母的8個營養(yǎng)缺陷突變體互補。根據(jù)這一特性可分離一些基因告私，如來自蛋白激酶基因和葡萄糖載體基因等屎暇。利用此法分離基因需做大量的轉(zhuǎn)化工作，且轉(zhuǎn)化細(xì)胞中突變體頻率較低驻粟。
f. 定位克隆
? ? ? 根據(jù)遺傳連鎖分析根悼，染色體步移將基因定位到染色體的一個具體位置上后不斷縮小篩選區(qū)域進(jìn)而克隆該基因。連鎖分析：通過基因與DNA標(biāo)記之間的重組系數(shù)估計兩者之間的距離蜀撑，若某種性狀的基因與DNA標(biāo)記在子代不分離挤巡，即有連鎖在一起的趨勢。因此可將與某一DNA標(biāo)記連鎖的基因在染色體上定位酷麦。
g. 轉(zhuǎn)座子標(biāo)記法
? ? ? 轉(zhuǎn)座子是可以從一個基因位置轉(zhuǎn)移到另一位置的DNA玄柏。轉(zhuǎn)座子標(biāo)記法是把轉(zhuǎn)座子作為基因定位的標(biāo)記和通過轉(zhuǎn)座子在染色體上? ? 的插入和嵌合來克隆基因。在轉(zhuǎn)座過程中贴铜，原來位置的轉(zhuǎn)座子并未消失粪摘，發(fā)生轉(zhuǎn)座的只是轉(zhuǎn)座子的拷貝∩馨樱基因發(fā)生轉(zhuǎn)座可引起插入突變徘意，使插入位置的基因失活并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型或在插入位置上出現(xiàn)新的編碼基因。通過轉(zhuǎn)座子上的標(biāo)記基因（如抗藥性等）就可以檢測出突變基因的位置和克隆出突變基因來轩褐。
一椎咧、基因的結(jié)構(gòu)
轉(zhuǎn)入正題，基因克隆完成后就要對基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析
? ? ? ? 近年來把介，很多科學(xué)家對植物基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究勤讽，結(jié)果表明它們與其他真核基因的結(jié)構(gòu)很相似。下面將他們對植物基因中4個區(qū)域結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果簡述如下：
1.1拗踢、5’上游區(qū)
? ? ? 這是指基因轉(zhuǎn)錄起始點5’端上游包括啟動子在內(nèi)的一段很長的區(qū)域脚牍，其中包含著與基因轉(zhuǎn)錄起始與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的許多元件。這個區(qū)域在結(jié)構(gòu)上有以下幾點值得注意：
a 轉(zhuǎn)錄起始位點
b TATA box巢墅、 CAAT box
c 順式作用元件
a 轉(zhuǎn)錄起始位點
? ? ? Joshi曾比較了79個高等植物基因啟動區(qū)的DNA順序诸狭，推衍出在基因轉(zhuǎn)錄起始點附近的一致順序(consensus sequence)是CTCATCA。當(dāng)中的一個A是轉(zhuǎn)錄起始的核苷酸君纫，一般都將此核苷酸編號為+1位驯遇。轉(zhuǎn)錄本中的核苷酸位置均以正數(shù)表示，而A的5’上游區(qū)非轉(zhuǎn)錄核苷酸則以負(fù)數(shù)表示蓄髓，A的兩邊通常是嘧啶核苷酸叉庐。
b TATA box、 CAAT box
? ? Joshi的總結(jié)中還指出会喝，在轉(zhuǎn)錄起始點上游－32±7核苷酸對(bp)處有一段一致順序TCACTATATAG，簡稱為TATA box，這些順序?qū)NA聚合酶Ⅱ準(zhǔn)確地使基因起始轉(zhuǎn)錄是必需的。在TATA box 上游-75bp附近常有一致順序GC(T／C)CAATCT，簡稱CAAT box．這些順序有增強(qiáng)基因特錄的作用媚赖。在有些植物基因中．沒有明顯的TATA box，在另一些植物基團(tuán)中催式，AGGA box替代了CAAT box
c 順式作用元件
? ? ? ? 在5’端遠(yuǎn)上游區(qū)域中．還存在對基因的表達(dá)有增強(qiáng)或阻遏作用的順序徽曲、決定基因在特定時空表達(dá)的順序以及對激素或外界脅迫有應(yīng)答作用的順序，由于這些順序?qū)虮磉_(dá)起調(diào)控作用反璃，因此統(tǒng)稱為調(diào)控元件昵慌，又由于它們與基因位于同一條DNA鏈上，故又稱順式作用元件(cis－acting element)淮蜈。有些研究論文中提到的啟動子有時也指包括了這些元件在內(nèi)的很長一段區(qū)域
1.2? 5’非翻譯區(qū)
? ? ? ? 基因的轉(zhuǎn)錄起始位點到翻譯起始密碼子之間的一段順序被稱為5’非翻譯區(qū)斋攀。該區(qū)的5’端是前體mRNA加帽(7-甲基鳥嘌呤核苷）的位點。有些基因的5’非翻譯區(qū)中還有一些莖環(huán)結(jié)構(gòu)梧田。這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)與翻譯起始密碼子的旁鄰順序?qū)Ψg的效率都有影響淳蔼。此外在有些值物基團(tuán)的5’非翻譯區(qū)中還鑒定出有內(nèi)含子存在。如在Ubiquitin基因裁眯、Sh基因鹉梨、Actin基因、Ashl基因與Wx基因的5’非翻譯區(qū)中均有內(nèi)含子存在穿稳，且這些內(nèi)含子都有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用存皂。
1.3? 編碼區(qū)
? ? 這是指從翻譯起始密碼列終止密碼之間的一段區(qū)域，或者說是指這一區(qū)域中的所有外顯子部分逢艘。
（1）Kozak比較了47種植物基因與植物病毒基因中翻譯起始位點附近的23個核苷酸旦袋，除了一個基因例外，其余的都是從5’端的第一個AUG作為翻譯起始密碼子的它改。例外的是菜豆的凝集素基因疤孕，它的轉(zhuǎn)錄本5’端有4個AUG，但彼此的讀碼框不同央拖∫雀蹋可能由于前面3個AUG的旁鄰順序不適宜核糖體的識別而不被使用，第4個AUG才是真正的翻譯起始密碼子爬泥。
（2）關(guān)于編碼區(qū)外顯子中4種核苷酸的比例柬讨，Murray統(tǒng)計了54種單子葉植物基因與3種雙子葉植物基因，總結(jié)出單子葉植物基因的AU含量為54％袍啡，雙子葉植物基因中AU含量為43％踩官。主要的差別是發(fā)生在密碼子的第3個堿基上，雙子葉植物基因?qū)境输、U蔗牡、C颖系、G 4種堿基的選用機(jī)率基本相似，而單子葉植物基因則偏向于選擇A與U辩越。
（3）像其他真核基因一樣嘁扼，植物基因的編碼區(qū)中也常有數(shù)目不等的內(nèi)含子，而且有些編碼區(qū)中的內(nèi)含子也有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用黔攒。
（4）有些真核基因中的一個外顯子正好對應(yīng)此基因所編碼蛋白質(zhì)中的一個結(jié)構(gòu)域趁啸，因此有人推測在基因演化過程中，一個內(nèi)含子可能會帶著相鄰的外顯子在基因間飄移督惰，從而構(gòu)成由不同結(jié)構(gòu)域組成的不同蛋白質(zhì)分子
1.4? 3’非翻譯區(qū)
? ? ? ? 指轉(zhuǎn)錄本中終止密碼子后面的一段順序不傅，這段順序中也有一些調(diào)控元件，它們對mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的效率均起重要的調(diào)節(jié)作用赏胚。
? ? ? Angenon等分析了748種植物基因中圍繞終止密碼子的18個核苷酸順序访娶，總結(jié)出所有3種已知的終止密碼子都能被植物基因用作翻譯終止訊號，但使用的比例則因植物的不同而有差別觉阅。單子葉植物基因使用UGA作為終止密碼的占46％崖疤，UAA與UAG的分別占28％與26％，而雙子葉植物首選UAA占46％典勇，而用UGA與UAG的分別為36％與18％劫哼，而琥珀密碼子UAG選用的百分比最低。 在mRNA末端有1或2個加polyA信號痴柔，多數(shù)植物基因均為AAUAAA沦偎，有少數(shù)基因其中的個別核苷酸有不同
