移動(dòng)終端花1決定了擬南芥種子的大小

摘要

種子大小是連接植物有性繁殖和后續(xù)幼苗建立的關(guān)鍵農(nóng)藝性狀，受雙施肥后胚乳增殖后胚乳纖維素化時(shí)間的影響。到目前為止幻锁，控制胚乳細(xì)胞化時(shí)間的分子開(kāi)關(guān)在很大程度上是不清楚的禾怠。在這里莫湘，我們報(bào)道了擬南芥終端花1 (TFL1)是在合點(diǎn)胚乳中產(chǎn)生的一種可移動(dòng)調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)穩(wěn)定脫落酸不敏感5（ABSCISIC ACID INSENSITIVE 5）而移動(dòng)到合胞外周胚乳中粗合，及時(shí)介導(dǎo)胚乳纖維素化和種子大小萍嬉。我們進(jìn)一步證明，ras相關(guān)的核GTPases與TFL1相互作用舌劳，并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)運(yùn)到合胞體外周胚乳帚湘。我們的研究結(jié)果表明，TFL1是調(diào)控胚乳細(xì)胞化和種子大小的重要分子開(kāi)關(guān)甚淡。在靠近母株維管組織的合點(diǎn)胚乳中產(chǎn)生可移動(dòng)TFL1大诸，為母株控制種子發(fā)育提供了一種迄今為止尚不清楚的手段。

種子的發(fā)育決定了開(kāi)花植物的進(jìn)化適應(yīng)性和作物產(chǎn)量贯卦。在種子發(fā)育的各種生長(zhǎng)參數(shù)中资柔，種子大小與種子萌發(fā)的養(yǎng)分水平和幼苗建立過(guò)程中對(duì)非生物脅迫的耐受性密切相關(guān)。因此撵割，在許多作物的馴化和育種過(guò)程中贿堰，種子大小始終是重要的農(nóng)藝性狀。到目前為止啡彬，對(duì)模型植物擬南芥種子大小控制的了解已為分子育種改善作物提供了重要的觀點(diǎn)羹与。擬南芥種子發(fā)育開(kāi)始于胚乳和珠皮的快速生長(zhǎng)故硅，形成大的種子腔，然后胚乳被胚所取代纵搁。種子腔的體積是影響種子最終大小的重要因素吃衅，它在空間上限制了胚的生長(zhǎng)。胚乳細(xì)胞化后腾誉，珠皮伸長(zhǎng)和胚乳擴(kuò)張通常終止徘层，細(xì)胞化定義了可用的空腔空間，使種子在隨后的胚擴(kuò)大過(guò)程中保持幾乎相同的大小利职。因此趣效，最終種子的大小受到胚乳細(xì)胞化時(shí)間的嚴(yán)格控制，而胚乳細(xì)胞化的中斷通常與種子大小的變化有關(guān)猪贪，如IKU通路中調(diào)節(jié)因子的突變跷敬。在該途徑中，HAIKU1(IKU1)哮伟、HAIKU2 (IKU2)和MINISEED3(MINI3)功能缺失干花，胚乳細(xì)胞化早熟，導(dǎo)致種子表型小楞黄，而下胚軸短功能缺失BLUE1（SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE1） (SHB1)池凄，導(dǎo)致胚乳細(xì)胞化延遲，種子大鬼廓。此外肿仑，脫落酸(ABA)被發(fā)現(xiàn)通過(guò)ABA不敏感5(ABI5)調(diào)節(jié)SHB1轉(zhuǎn)錄，影響胚乳細(xì)胞化的時(shí)間碎税，并負(fù)向調(diào)節(jié)種子大小尤慰。在精子核與雙核中央細(xì)胞受精后，產(chǎn)生的初生胚乳核經(jīng)歷了沒(méi)有細(xì)胞質(zhì)分裂的有絲分裂雷蹂，產(chǎn)生合胞胚乳伟端，它在空間上分為三個(gè)區(qū)域;微孔，合點(diǎn)和外周胚乳匪煌。微孔胚乳圍繞在胚和胚柄周圍责蝠，合點(diǎn)胚乳位于與胚相對(duì)的合點(diǎn)極。在種子發(fā)育的最初階段萎庭，外周胚乳在中央大液泡的作用下作為外周層擴(kuò)散霜医。經(jīng)過(guò)8輪合胞體分裂后，微孔和外周胚乳隨后發(fā)生細(xì)胞化驳规，而合點(diǎn)胚乳始終保持合胞狀態(tài)肴敛。超微結(jié)構(gòu)研究表明，合點(diǎn)胚乳靠近母體的血管組織，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或信號(hào)的攝取医男、再加工和運(yùn)輸中起著胚乳吸器的作用砸狞。盡管有這些研究，但合點(diǎn)胚乳在種子發(fā)育中的作用的分子機(jī)制仍然完全未知昨登。

在本研究中趾代，我們報(bào)道了終端花1 (TFL1)，一種磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族成員丰辣，先前在擬南芥中被稱為芽識(shí)別基因，通過(guò)調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)呐呷槔w維素化時(shí)間禽捆，在決定種子大小方面發(fā)揮了重要作用笙什。我們證明了一組小的gtp結(jié)合ras相關(guān)核蛋白(RAN)介導(dǎo)了TFL1蛋白從合點(diǎn)胚乳向合胞外周胚乳(SPE)的轉(zhuǎn)運(yùn)，在SPE中TFL1穩(wěn)定ABI5胚想，從而介導(dǎo)了胚乳和種子的及時(shí)纖維素化琐凭。

結(jié)果

TFL1功能缺失突變體表現(xiàn)出較大的種子表型。在研究TFL1調(diào)控花序的過(guò)程中在擬南芥的結(jié)構(gòu)中浊服，我們發(fā)現(xiàn)其功能缺失突變體tfl1-1和tfl1-20表現(xiàn)出明顯的變異大種子表型(圖1a,b)统屈，

圖1?|?TFL1影響種子大小。?a牙躺，tfl1突變體愁憔，TFL1：GUS和各種基因組TFL1（gTFL1）構(gòu)建體的示意圖。倒三角形或箭頭分別指示T-DNA插入位點(diǎn)（tfl1-20）或甲磺酸乙酯突變位點(diǎn)（tfl1-1）孽拷。外顯子吨掌，內(nèi)含子和非翻譯區(qū)分別由黑色，灰色和白色框表示脓恕。其他基因組區(qū)域用黑線表示膜宋。相對(duì)于翻譯起始密碼子的第一個(gè)核苷酸編號(hào)為+1的核苷酸序列

圖1b，野生型（WT）炼幔，tfl1-20和tfl1-1植物成熟干種子的比較秋茫。比例尺，500μm乃秀。

這與成熟胚的尺寸增大有關(guān)(圖1c)肛著。

WT，tfl1-20和tfl1-1植物成熟胚的比較环形。比例尺策泣，500μm。?b抬吟，c中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行了三次萨咕，結(jié)果相似。

進(jìn)一步檢查轉(zhuǎn)移- dna(T-DNA)插入突變體的種子中火本，tfl1-20揭示了種子大小的主要參數(shù)危队，包括種子面積聪建、周長(zhǎng)、長(zhǎng)茫陆、寬金麸、長(zhǎng)/寬和種子質(zhì)量顯著與野生型種子相比，tfl1-20增加(圖1d)簿盅，

WT和tfl1-20植物種子大小和質(zhì)量的定量分析挥下。箱形圖顯示了500?WT和tfl1-20種子的種子大小參數(shù)（面積，周長(zhǎng)桨醋，長(zhǎng)度棚瘟，寬度和長(zhǎng)度/寬度比）的中位數(shù)（線），四分位數(shù)范圍（框）和晶須（擴(kuò)展1.5倍四分位數(shù)范圍）喜最。種子質(zhì)量是五個(gè)樣本批次的平均值偎蘸，每個(gè)樣本包含500個(gè)種子。

而tfl1-20的每角果粒數(shù)與野生型植物相當(dāng)(補(bǔ)充圖1a,b)瞬内。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1?|?gTFL1-3HA和gTFL1-GFP可以挽救tfl1-20的早期開(kāi)花和末端花表型迷雪。?a，tfl1-20比野生型（WT）植物和獨(dú)立的tfl1-20?gTFL1-3HA或tfl1-20?gTFL1-GFP轉(zhuǎn)基因株系早開(kāi)花虫蝶。?b章咧，獨(dú)立的tfl1-20?gTFL1-3HA和tfl1-20?gTFL1-GFP轉(zhuǎn)基因品系像WT植物一樣發(fā)育正常的花序頂端，而tfl1-20則發(fā)育頂生花（a）秉扑。比例尺慧邮，2厘米。

為了證實(shí)TFL1 -20大種子表型歸因于TFL1功能的喪失舟陆，我們將TFL1 -20轉(zhuǎn)化為含有a的gTFL1-3HA和gfp的基因組構(gòu)建8.41-kb TFL1基因組片段误澳，包括2.74-kb的5 '上游序列，4.63-kb 3 '下游序列秦躯，以及整個(gè)序列1.04 kb編碼區(qū)域與3HA或綠色熒光框融合蛋白(GFP)標(biāo)簽分別位于終止密碼子標(biāo)簽之前(圖1a)忆谓。絕大多數(shù)tfl1-20 gTFL1-3HA和tfl1-20 gTFL1-GFP的獨(dú)立轉(zhuǎn)子表現(xiàn)出與野生型植株相似的種子表型(圖1e)。

基于a3：1孟德?tīng)柗蛛x比踱承，對(duì)可能在單個(gè)位點(diǎn)包含轉(zhuǎn)基因的代表性tfl1-20?gTFL1-3HA和tfl1-20?gTFL1-GFP系的種子大小參數(shù)進(jìn)行定量分析倡缠。箱形圖顯示了不同基因型（tfl1-20，n?=?148;?WT茎活，n?=?106;?tfl1-20）種子的種子大小參數(shù)的中位數(shù)（線）昙沦，四分位間距（框）和晶須（擴(kuò)展1.5×四分位間距）?gTFL1-3HA?1、2载荔、4號(hào)分別為n?=?100盾饮、102、106;?tfl1-20?gTFL1-GFP?1、2丘损、3號(hào)分別為n?=?108普办、126、131）徘钥。選擇紅色框突出顯示的線以進(jìn)行進(jìn)一步分析衔蹲。在框圖中顯示了相對(duì)于設(shè)定為100％的WT植物平均值的特定基因型種子參數(shù)的百分比變化（％）。?d呈础，e中的星號(hào)表示tfl1-20與其他基因型之間存在顯著差異（用于種子質(zhì)量比較的兩尾Student?t檢驗(yàn)舆驶；用于其他比較的兩尾Mann-Whitney檢驗(yàn)，P?<0.0001）而钞。在d贞远，e中，種子大小參數(shù)的所有P值均小于1×10-15笨忌，而在d中，種子質(zhì)量的P值為4.67×10-13俱病。

此外官疲，gTFL1-3HA和gTFL1-GFP也完全挽救了tfl1-20的其他發(fā)育缺陷，包括早花和終花表型(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a,b)亮隙。這些結(jié)果表明途凫，TFL1與TFL1 -20中觀察到的種子大小表型有關(guān)，而gTFL1基因組片段包含了TFL1活性所需的必要調(diào)控元件溢吻。我們進(jìn)一步為tfl1-20 gTFL1-3HA和tfl1-20 gTFL1-GFP分別選擇了一個(gè)代表性株系(圖1e)维费，根據(jù)3:1的孟氏分離比，該株系可能包含在單個(gè)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因促王，以供進(jìn)一步研究犀盟。

TFL1通過(guò)影響胚乳細(xì)胞化來(lái)確定種子大小。對(duì)tfl1-20和野生型種子進(jìn)行授粉后1至7 d的組織學(xué)分析（DAP）顯示蝇狼，它們的胚胎發(fā)育進(jìn)展相似（圖2a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a）阅畴，而它們的種子腔卻變得不同 在球狀階段后第3天DAP更明顯（圖2a，b）迅耘。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2?|?TFL1影響胚乳細(xì)胞化贱枣。?a，在授粉后1颤专、2和6天纽哥，清晰的野生型（WT）和tfl1-20植物的整粒種子的微分干涉對(duì)比（DIC）顯微鏡。比例尺栖秕，50μm春塌。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地重復(fù)了三遍，結(jié)果相似。

圖2?|胚乳細(xì)胞化在tfl1-20中被延遲摔笤。?a够滑，在DAP，3吕世、4彰触、5和7處清晰的野生全野生型（WT）和tfl1-20種子的DIC顯微鏡檢查。比例尺命辖，50μm况毅。?b，在1–7?DAP時(shí)WT和tfl1-20種子腔面積的比較尔艇。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢查隨機(jī)選擇的種子（WT種子在1-7?DAP尔许，n?=?15、11终娃、12味廊、12、14棠耕、13和9余佛；?tfl1-20種子在1-7?DAP，n?=?12窍荧，n?=?12?12辉巡、10、14蕊退、13郊楣、11和9）。值是平均值±s.d。每天的WT平均值設(shè)置為100％。星號(hào)表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（兩尾學(xué)生t檢驗(yàn)锥咸，P?<0.01）。?NS塞栅，不顯著。1–7?DAP的P值分別為0.628腔丧、0.811放椰、0.313、8.99×10-3愉粤、1.11×10-7砾医、4.31×10-8和7.75×10-8。

從4 DAP球心過(guò)渡期開(kāi)始衣厘，tfl1-20的種子腔明顯大于野生型種子(圖2b)如蚜，這與tfl1-20與野生型種子的尺寸差異一致(圖2a及擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a)压恒。

由于tfl1-20在4 DAP時(shí)可以檢測(cè)到種子腔表型的增大，我們通過(guò)監(jiān)測(cè)戊二醛固定胚乳細(xì)胞產(chǎn)生的自發(fā)熒光错邦，對(duì)3 - 5 DAP時(shí)tfl1-20和野生型種子的胚乳發(fā)育進(jìn)行共聚焦顯微鏡分析探赫。值得注意的是，野生型外周胚乳在過(guò)渡期(4 DAP)進(jìn)行了細(xì)胞化撬呢，而在tfl1-20種子中伦吠，胚乳細(xì)胞化延遲到心臟期(5 DAP)(圖2c和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2b)。此外魂拦，對(duì)過(guò)渡期石蠟包埋的種子進(jìn)行組織學(xué)分析(4 DAP)也發(fā)現(xiàn)毛仪，只有野生型的外周胚乳部分細(xì)胞化，而tfl1-20的種子沒(méi)有(圖2d)芯勘。

c箱靴，通過(guò)共聚焦顯微鏡比較在3–5?DAP下清除的全野生WT和tfl1-20種子的外圍胚乳發(fā)育。通過(guò)戊二醛處理產(chǎn)生自發(fā)熒光（綠色熒光）信號(hào)荷愕。箭頭指示胚乳細(xì)胞化過(guò)程中的新細(xì)胞壁衡怀。合并，合并綠色熒光和明場(chǎng)圖像安疗。比例尺狈癞，50μm。

b茂契，通過(guò)共聚焦顯微鏡檢查在3至5?DAP時(shí)WT和tfl1-20中具有合胞體或細(xì)胞化的外圍胚乳的種子的百分比。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢查從每種基因型的10個(gè)以上角果中隨機(jī)選擇的種子慨绳。

d掉冶，在4?DAP時(shí)WT和tfl1-20種子的組織學(xué)分析。?CPE脐雪，細(xì)胞化的外圍胚乳厌小；CV，中央液泡;?CZE战秋，合點(diǎn)端璧亚；?EM，胚芽脂信。比例尺癣蟋，50μm。

這些觀察結(jié)果表明狰闪，與野生型種子相比疯搅，tfl1-20的胚乳細(xì)胞化延遲。

TFL1蛋白是種子發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)移動(dòng)信號(hào)埋泵。為了了解TFL1是如何影響胚乳纖維素化和種子大小的幔欧，我們對(duì)從野生型植物的不同組織中提取的總RNA進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析罪治。TFL1信使RNA (mRNA)幾乎在葉片中表達(dá)最低的所有組織中普遍表達(dá)，而在發(fā)育中的角突中礁蔗，TFL1信使RNA (mRNA)在過(guò)渡期前表達(dá)降低(4 DAP)觉义，在過(guò)渡期后表達(dá)增加(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3a)。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3?|?TFL1?mRNA和蛋白在擬南芥中的表達(dá)浴井。?a晒骇，擬南芥授粉后2至7天（DAP；下圖）在各種組織（上圖）或發(fā)育中的角果樹(shù)中TFL1?mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR分析滋饲。?OF厉碟，開(kāi)花；?IS屠缭，花序莖箍鼓；?RL，蓮座葉呵曹；?Rt款咖，根；sil：長(zhǎng)角果奄喂；?CL铐殃，莖生葉；?FB跨新，花蕾富腊。將結(jié)果相對(duì)于作為內(nèi)部對(duì)照的U-BOX基因的表達(dá)水平進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。下部面板中的表達(dá)水平顯示為相對(duì)于設(shè)置為1的2?DAP水平的相對(duì)值域帐。值是三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD赘被。

對(duì)正在發(fā)育的種子進(jìn)行原位分析發(fā)現(xiàn)，TFL1 mRNA在合點(diǎn)胚乳中特異表達(dá)肖揣，而在過(guò)渡階段的SPE中沒(méi)有特異表達(dá)(圖3a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b)民假。

圖3?|?TFL1?mRNA和蛋白質(zhì)在發(fā)育中的種子中的定位。?a龙优，使用TFL1反義或有義探針羊异，在發(fā)育中的種子中DFL在4個(gè)DAP（左兩圖）和4.5（右兩個(gè)圖）DAP中原位定位。比例尺彤断，100μm野舶。

b，使用TFL1反義或有義探針在4?DAP發(fā)育種子中TFL1表達(dá)的原位定位宰衙。?SPE筒愚，合胞體周圍胚乳；?CZE菩浙，合點(diǎn)端巢掺。比例尺句伶，100μm

我們進(jìn)一步構(gòu)建了TFL1:葡萄糖醛酸苷酶(GUS)報(bào)告基因結(jié)構(gòu)，其中GUS基因在用于基因互補(bǔ)試驗(yàn)的TFL1基因組片段中包含的相同的5個(gè)上游和3個(gè)下游序列之間融合(圖1a)陆淀。在過(guò)渡階段種子合點(diǎn)胚乳中再次檢測(cè)到強(qiáng)烈的GUS信號(hào)(圖3b)考余。

b，在4DAP時(shí)TFL1：GUS種子的GUS染色轧苫。比例尺楚堤，100μm.c，擬南芥eFP瀏覽器中顯示的公共微陣列數(shù)據(jù)中TFL1在種子中的表達(dá)模式

這些結(jié)果含懊，加上擬南芥eFP瀏覽器中公共芯片數(shù)據(jù)分析的TFL1表達(dá)模式(圖3c)身冬，顯示了TFL1 mRNA在合點(diǎn)胚乳中的特異性表達(dá)。

為了檢驗(yàn)TFL1蛋白在發(fā)育中的定位岔乔，我們利用建立的TFL1- 20 gTFL1-GFP轉(zhuǎn)基因株系(圖1a)酥筝，其中TFL1- gfp能夠挽救TFL1- 20的多效缺陷(圖1e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1)。共聚焦顯微鏡分析檢測(cè)到在花序雏门、芽頂端分生組織和根韌皮部組織中存在TFL1-GFP信號(hào)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c,d)嘿歌，如之前的研究所示，表明可追蹤的TFL1-GFP具有體內(nèi)生物學(xué)功能茁影。

c宙帝，d，TFL1-GFP在花序分生組織（c）和tfl1-20?gTFL1-GFP的根（d）中的定位募闲。合并步脓，合并GFP和明場(chǎng)圖像。比例尺浩螺，20μm沪编。

在SPE中可以大量檢測(cè)到TFL1-GFP蛋白，但在發(fā)育中的種子的合點(diǎn)胚乳中只能檢測(cè)到微弱的TFL1-GFP蛋白(圖3d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3e年扩、f和4a)。

d访圃，通過(guò)冷凍切片在4?DAP處將tfl1-GFP定位在發(fā)育中的tfl1-20?gTFL1-GFP種子中厨幻。在SPE（上圖）中可以觀察到TFL1-GFP信號(hào)。下面板是上面顯示的SPE的特寫(xiě)視圖腿时。具有增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度的相應(yīng)圖像在圖3e的擴(kuò)展數(shù)據(jù)中示出况脆。?BF，明場(chǎng)圖像批糟；Merge格了，合并GFP和BF圖像。比例尺徽鼎，50μm盛末。

e弹惦，與圖3d所示相比，在增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度下悄但，通過(guò)冷凍切片在4?DAP下Tfl1-GFP在發(fā)育中的tfl1-20?gTFL1-GFP種子中的定位棠隐。?TFL1-GFP信號(hào)在瞼板胚乳中比在合胞體周圍胚乳中弱得多（上圖）。下面板是上面所示的合點(diǎn)端胚乳及其附近合胞體周圍胚乳的特寫(xiě)視圖檐嚣。?BF助泽，明場(chǎng)圖像。?CZE嚎京，合點(diǎn)端嗡贺；?EM，胚胎鞍帝；?GFP和BF圖像的合并诫睬，合并；?SPE膜眠，合胞體周圍胚乳岩臣。比例尺，50μm宵膨。

f架谎，在4?DAP時(shí)檢測(cè)野生型種子中的背景綠色熒光信號(hào)。該圖像是在與圖1相同的條件下獲得的辟躏。圖3d用作圖3d的陰性對(duì)照谷扣。自身熒光（綠色熒光）信號(hào)幾乎可以檢測(cè)到。比例尺捎琐，50μm会涎。

TFL1定位在SPE的透射電子顯微鏡進(jìn)一步證實(shí)tfl1-20 gTFL1-3HA轉(zhuǎn)基因線(圖3 e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4 c)

e，使用抗HA抗體通過(guò)免疫金電子顯微鏡分析tfl1-20?gTFL1-3HA（左圖）相對(duì)于野生型（WT瑞凑，右圖）種子在4?DAP的外周胚乳中的TFL1-3HA定位末秃。中間面板是左側(cè)面板中所示框內(nèi)區(qū)域的更高放大倍數(shù)。箭頭指示金顆粒籽御。比例尺练慕，2μm。

使用抗HA抗體通過(guò)免疫金電子顯微鏡對(duì)tfl1-20?gTFL1-3HA種子在4?DAP的合胞體外周胚乳中的TFL1-3HA細(xì)胞質(zhì)定位進(jìn)行分析技掏。下面板顯示了上面板指示的框內(nèi)區(qū)域的更高放大倍數(shù)铃将。箭頭指示金顆粒。原子核中沒(méi)有可檢測(cè)到的金顆粒哑梳。cv劲阎，中央液泡;?iCW，ii1的細(xì)胞壁鸠真；?ii1悯仙，內(nèi)被膜的最內(nèi)層細(xì)胞層（內(nèi)皮細(xì)胞）龄毡；

,其中TFL1-3HA獲救的多向性的缺陷TFL1 - 20(圖1 e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1),并被使用anti-HA抗體免疫印跡分析(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3 g)。

g雁比，選擇的tfl1-20?gTFL1-3HA轉(zhuǎn)基因株系中的TFL1-3HA蛋白（箭頭）的蛋白質(zhì)印跡分析稚虎，根據(jù)其分離比例可能包含一個(gè)T-DNA插入位點(diǎn)。從年輕的長(zhǎng)角果中提取總蛋白偎捎，并使用抗HA抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析蠢终。

我們還注意到，TFL1-GFP定位在合胞體或發(fā)育中的種子中每個(gè)胚乳核周圍密集的細(xì)胞質(zhì)中積累的細(xì)胞化的外圍胚乳（圖3d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3e和4a–c）茴她，

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4?|?TFL1在擬南芥中的細(xì)胞質(zhì)定位寻拂。?a，b丈牢，通過(guò)冷凍切片在授粉后（DAP）第4（a）和5（b）天祭钉，用DAPI染色的發(fā)育中的tfl1-20?gTFL1-GFP種子中TFL1-GFP的定位。合胞體（a）和細(xì)胞化（b）外圍胚乳中的TFL1-GFP信號(hào)與DAPI染色不共定位己沛。?（a）或（b）中每個(gè)圖中的插圖分別顯示了合胞體或細(xì)胞化的外圍胚乳的一個(gè)擴(kuò)大的核慌核。?DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚的熒光申尼；?BF垮卓，明場(chǎng)圖像；Mwege师幕，合并GFP粟按，DAPI和BF圖像。比例尺霹粥，50μm灭将。

在花序分生組織細(xì)胞這是一致的。

對(duì)TFL1- 20 gTFL1-3HA 長(zhǎng)角果中提取蛋白的TFL1- 3HA進(jìn)行進(jìn)一步免疫印跡分析后控，證實(shí)TFL1特異性定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖3f)庙曙。

f，通過(guò)細(xì)胞分級(jí)測(cè)定法顯示了TFL1的亞細(xì)胞定位浩淘。使用抗HA抗體進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析捌朴，以檢查從tfl1-20?gTFL1-3HA年輕小果提取的核（N）或細(xì)胞質(zhì)（C）級(jí)分中的TFL1蛋白。與細(xì)胞溶質(zhì)部分相比馋袜，核部分過(guò)量十倍。用麗春紅S染色的RbcL和使用抗組蛋白3（H3）的免疫印跡分析分別用作細(xì)胞溶質(zhì)和核級(jí)分的指標(biāo)舶斧。?iCW欣鳖，ii1的細(xì)胞壁；?ii1茴厉，內(nèi)被膜的最內(nèi)層細(xì)胞層（內(nèi)皮細(xì)胞）泽台；?PSV什荣，蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液泡。

這些對(duì)發(fā)育中的種子的表達(dá)分析表明怀酷，TFL1 mRNA在合點(diǎn)胚乳中特異表達(dá)(圖3a c和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b)稻爬，其蛋白在SPE的細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)(圖3d,e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3e和4a,c)。

RAN蛋白是TFL1的潛在介質(zhì)蜕依。為了深入了解TFL1在合胞體胚乳內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制桅锄，我們進(jìn)行了免疫沉淀質(zhì)譜(IP MS)和下拉質(zhì)譜(PD MS)分析，以確定種子中TFL1的相互作用同伴样眠。用抗ha抗體免疫沉淀tfl1-20 gTFL1-3HA角果總蛋白提取物進(jìn)行IP MS友瘤，用重組蛋白MBP-TFL1拉低其在野生型角果總蛋白提取物中的相互作用蛋白進(jìn)行PD MS。從兩種方法獲得純化物然后通過(guò)液相色譜分析與串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS / MS）結(jié)合使用檐束。這鑒定出了兩個(gè)多肽(LVIVGDGGTGK和NLQYYEISAK)(圖4a)辫秧，

圖4?|?TFL1與RAN蛋白相互作用。?a被丧，通過(guò)PD-MS或IP-MS方法確定的TFL1交互伙伴盟戏。所鑒定的RAN肽具有高可信度，顯示在相應(yīng)的質(zhì)譜圖上方

它們位于三個(gè)推測(cè)的Ran GTPases RAN1-3(圖4b和補(bǔ)充圖2）

b甥桂，RAN1柿究，RAN2和RAN3的氨基酸序列相似性。如a所示格嘁，可以通過(guò)PD-MS（肽1）和IP-MS（肽2）檢測(cè)到藍(lán)色突出顯示的區(qū)域笛求。框出的區(qū)域表示RAN1糕簿，RAN2和RAN3中的可變C末端探入。從0到+1的相似度表示最低到最高的序列同源性。

中氨基酸序列100%的保守區(qū)域懂诗，參與核漿轉(zhuǎn)運(yùn)蜂嗽，具有高度的序列相似性。

為了了解RAN基因的生物學(xué)功能殃恒，我們從擬南芥生物資源中心獲得了RAN2的RAN2 -1植旧、RAN3的RAN3 -1、RAN3 -2 3個(gè)T-DNA插入株(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a)离唐。由于RAN2 -1和RAN3在RAN3 -1和RAN2 -1中幾乎檢測(cè)不到RAN2和RAN3(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5b)病附，我們使用這兩株進(jìn)行進(jìn)一步的表型分析。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5?|分離RAN1亥鬓，RAN2和RAN3功能喪失的突變體完沪。?a，示意圖，顯示了RAN1覆积，RAN2和RAN3基因組區(qū)域听皿，以及CRISPR-Cas9靶位點(diǎn)（ran1-3和ran1-4）或T-DNA插入位點(diǎn)（ran2-1，ran3-1和ran3-2）宽档。

b尉姨，定量分析其相應(yīng)的T-DNA插入突變體中的RAN2或RAN3表達(dá)。將結(jié)果相對(duì)于作為內(nèi)部對(duì)照的U-BOX基因的表達(dá)水平進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化吗冤。值是三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD又厉。

雖然RAN1 -1和RAN1 -2這兩個(gè)T-DNA插入位點(diǎn)位于RAN1的5 '啟動(dòng)子區(qū)域的突變體已經(jīng)被報(bào)道，但這兩個(gè)突變體中RAN1的表達(dá)僅部分下調(diào)欣孤。因此馋没，我們利用聚集規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9 (Cas9)技術(shù)對(duì)RAN1進(jìn)行了靶向突變。由于RAN1和RAN2在5號(hào)染色體上物理連接(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a)降传，我們分別在野生型和RAN2 -1背景中創(chuàng)建了RAN1 -3和RAN1 -4篷朵。RAN1 -3和RAN1 -4分別在第2外顯子和第5外顯子開(kāi)始的1-bp胸腺嘧呤(T)插入處進(jìn)行了短的缺失，導(dǎo)致RAN1蛋白R(shí)AN域25的特征被破壞(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a,c,d)婆排。

c声旺，d，在野生型（c）和ran2-1（d）背景中段只，CRISPR?/?Cas9介導(dǎo)的RAN1的靶誘變腮猖。上圖中的下劃線標(biāo)出了RAN1中的CRISPR?/?Cas9目標(biāo)位點(diǎn)。新創(chuàng)建的ran1-3單突變體（c）和ran1-4?ran2-1雙突變體（d）在RAN1的第二個(gè)外顯子處含有短缺失赞枕，在第5個(gè)外顯子的開(kāi)始處含1-bp胸腺嘧啶（T）（均以黑框突出顯示）澈缺。指出了RAN1蛋白中ran1-3和ran1-4?ran2-1中突變的位置。

這些突變體對(duì)應(yīng)于RAN1中CRISPR / Cas9靶位點(diǎn)的RAN2和/或RAN3序列在ran1-3和ran1-4 ran2-1中保持不變（補(bǔ)充圖3）炕婶，表明CRISPR / Cas9介導(dǎo)的靶誘變特異性修飾了RAN1中的RAN1序列姐赡。?

在ran1-3、ran2-1和ran3-1單突變體中柠掂，ran2-1種子大小參數(shù)較野生型種子變化微弱(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5e)项滑，而ran2-1種子大小表型在ran1-4和ran3-1背景下進(jìn)一步增強(qiáng)(圖4c)。

e涯贞，ran1-3枪狂，ran2-1和ran3-1種子大小參數(shù)的定量分析。箱形圖顯示了不同基因型種子的種子大小參數(shù)（面積宋渔，周長(zhǎng)州疾，長(zhǎng)度和寬度）的中位數(shù)（線），四分位數(shù)間距（框）和晶須（延伸四分位數(shù)間距的1.5倍）（WT皇拣，n?=?692严蓖；?ran1-3，n?=?153；?ran2-1谈飒，n?=?516；?ran3-1态蒂，n?=?461）杭措。值代表突變體的種子參數(shù)相對(duì)于設(shè)定為100％的WT植物平均值的百分比變化（％）。星號(hào)表示野生型植物與其他基因型之間存在顯著差異（兩尾曼恩-惠特尼檢驗(yàn)钾恢，P?<0.0001）手素。?n.s，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異胃榕。對(duì)于種子區(qū)域植袍，WT與ran1-3涤姊，ran2-1和ran3-1的P值分別為0.000193，<1×10-15和0.461崩哩。種子周長(zhǎng)分別為0.0463、4.378×10?7和0.988言沐；種子長(zhǎng)度分別為0.0333邓嘹、0.800和2.43×10-6;種子寬度分別為0.000409，<1×10-15和0.000164

c险胰，對(duì)雙突變體種子大小參數(shù)的定量分析汹押。箱形圖顯示了不同基因型（野生型（WT），n?=?692起便；?ran1-4?ran2-1棚贾，種子號(hào)）的種子大小參數(shù)的中位數(shù)（線），四分位數(shù)范圍（框）和晶須（擴(kuò)展了1.5倍四分位數(shù)范圍）?n?=?395榆综；?ran2-1?ran3-1妙痹，n?=?647）。顯示了相對(duì)于設(shè)定為100％的WT植物平均值的雙重突變體的種子參數(shù)的百分比變化（％）奖年。每個(gè)框上方標(biāo)出了雙突變體相對(duì)于WT的百分比增加细诸。星號(hào)表示野生型植物與其他基因型之間的顯著差異（兩尾曼恩-惠特尼檢驗(yàn)，P?<0.0001）陋守。?WT和ran2-1?ran3-1之間的種子長(zhǎng)度的P值為4.44×10-11震贵，而其他P值均小于1×10-15。

這些突變體的組合沒(méi)有產(chǎn)生RAN1-3的純合三重突變體水评，說(shuō)明它們?cè)谏嘲l(fā)育或種子發(fā)育中都起著重要的作用猩系。此外，RAN1-3在幾乎所有被檢測(cè)組織中普遍表達(dá)中燥，但RAN2表達(dá)水平明顯高于RAN1和RAN3(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a)寇甸。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6?|分析RAN1，RAN2和RAN3表達(dá)模式。?a拿霉，定量分析授粉后2至7天（DAP吟秩，下圖）中各種組織（上圖）或正在形成的長(zhǎng)角果中RAN1，RAN2和RAN3表達(dá)的定量分析绽淘。?OF涵防，開(kāi)花；?IS沪铭，花序莖壮池；?RL，蓮座葉杀怠；?Rt椰憋，根；sil赔退，長(zhǎng)角果橙依；?CL，莖生葉硕旗；?FB票编，花蕾。將結(jié)果相對(duì)于作為內(nèi)部對(duì)照的U-BOX基因的表達(dá)水平進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化卵渴。下部面板中的表達(dá)水平顯示為相對(duì)于設(shè)置為1的2?DAP水平的相對(duì)值慧域。值是三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。

這些觀察結(jié)果表明浪读，盡管RAN1-3在影響種子大小和可能的其他發(fā)育過(guò)程中起著多余的作用昔榴，但RAN2可能是一個(gè)相對(duì)重要的角色。 因此碘橘，我們選擇RAN2作為代表性的RAN基因互订，以研究其在隨后的實(shí)驗(yàn)中對(duì)種子大小的介導(dǎo)作用。為了了解RAN2蛋白在發(fā)育中的表達(dá)情況痘拆，我們創(chuàng)建了表達(dá)4.9 kb RAN2基因組片段的GUS- gran2報(bào)告基因系仰禽，其中包含2.2 kb - 5的上游序列，GUS報(bào)告基因翻譯融合到1.6 kb - RAN2編碼區(qū)和1.1 kb - 3的下游序列纺蛆。大多數(shù)GUS-gRAN2報(bào)告株在發(fā)育完整的種子中顯示了相似的染色模式(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6b)吐葵，

b，在1至5個(gè)DAP時(shí)GUS-gRAN2種子的GUS染色桥氏。比例尺温峭，50μm。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地重復(fù)了三遍字支，結(jié)果相似凤藏。

包括TFL1定位的SPE奸忽。

RAN蛋白介導(dǎo)TFL1向SPE的轉(zhuǎn)運(yùn)。之后我們使用各種方法對(duì)TFL1和RAN2之間的交互進(jìn)行了詳細(xì)的分析揖庄。下拉實(shí)驗(yàn)表明栗菜，從35S中提取的TFL1-4HA:TFL1-4HA siliques結(jié)合到vitro-翻譯的MBP- ran2蛋白上，但不結(jié)合MBP本身(圖4d)蹄梢。

d苛萎，TFL1和RAN蛋白之間相互作用的下拉分析。?MBP和MBP-RAN1?/?2/3用作誘餌检号，并用Ponceau?S（下圖）對(duì)相應(yīng)的上樣對(duì)照進(jìn)行染色。使用抗HA抗體通過(guò)免疫印跡分析檢查了從35S：TFL1-4HA片段提取的獵物蛋白TFL1-4HA的輸入及其相應(yīng)的下拉信號(hào)（上圖）蛙酪。

TFL1-4HA與MBP-RAN1或MBP-RAN3之間存在類似的相互作用(圖4d)齐苛。進(jìn)一步對(duì)TFL1和各種RAN2截?cái)嗟鞍字g的相互作用進(jìn)行拉下分析，發(fā)現(xiàn)RAN2中與蛋白相互作用有關(guān)的效應(yīng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的缺失桂塞，部分影響了它們的相互作用(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7a,b)凹蜂。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7?|?TFL1與RAN2的顯性陰性（DN-ran2）或截短形式之間的相互作用的下拉分析.a，與MBP融合的DN-ran2和RAN2截短（Del1-Del3）蛋白的示意圖阁危。全長(zhǎng)RAN2蛋白包含與蛋白-蛋白相互作用有關(guān)的效應(yīng)子結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酸性C-末端結(jié)構(gòu)域玛痊。?DN-ran2蛋白在殘基27處含有蘇氨酸（T）突變?yōu)樘於０罚∟），其位于RAN2的效應(yīng)子結(jié)合域附近狂打。?b擂煞，下拉測(cè)定結(jié)果。?MBP和各種MBP融合蛋白用作誘餌趴乡，并用Ponceau?S（下圖）對(duì)相應(yīng)的上樣對(duì)照進(jìn)行染色对省。使用抗-HA抗體通過(guò)免疫印跡分析檢查了從35個(gè)S：TFL1-4HA片段中提取的獵物蛋白TFL1-4HA的輸入及其相應(yīng)的下拉信號(hào)（上圖）。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地重復(fù)了三遍晾捏，結(jié)果相似蒿涎。

為了研究TFL1和RAN2在體內(nèi)的相互作用，我們生成了RAN2- 1 gRAN2-3FLAG轉(zhuǎn)基因植株惦辛，其中3FLAG與GUS-gRAN2的相同RAN2基因組片段融合劳秋，挽救了RAN2- 1的種子大小表型。對(duì)ran2- gRAN2-3FLAG tfl1- 20 gTFL1-3HA 長(zhǎng)角果總提取物的共免疫沉淀(CoIP)分析證實(shí)了RAN2-3FLAG和tfl1- 3ha之間的體內(nèi)相互作用(圖4e)胖齐。

e玻淑，CoIP顯示的擬南芥果蠅中TFL1-3HA和RAN2-3FLAG之間的體內(nèi)相互作用。用抗HA抗體免疫沉淀WT或tfl1-20?gTFL1-3HA背景下ran2-1?gRAN2-3FLAG的年輕小種的總蛋白提取物呀伙。使用抗HA（下圖）或抗FLAG（上圖）抗體通過(guò)免疫印跡分析檢查輸入的和共免疫沉淀的蛋白質(zhì)岁忘。

這些結(jié)果表明在種子中TFL1與RAN2相互作用。

與tfl1-20相比(圖1b d)区匠， RAN1-3的單干像、雙突變體的種子大小表型相對(duì)較弱(圖4c和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5e)帅腌，而純合的三重突變體則無(wú)法存活。

e麻汰，ran1-3速客，ran2-1和ran3-1種子大小參數(shù)的定量分析。箱形圖顯示了不同基因型種子的種子大小參數(shù)（面積五鲫，周長(zhǎng)溺职，長(zhǎng)度和寬度）的中位數(shù)（線），四分位間距（框）和晶須（延伸四分位間距的1.5倍）（WT位喂，n?=?692浪耘；?ran1-3，n?=?153塑崖；?ran2-1七冲，n?=?516；?ran3-1规婆，n?=?461）澜躺。值代表突變體的種子參數(shù)相對(duì)于設(shè)定為100％的WT植物平均值的百分比變化（％）。星號(hào)表示野生型植物與其他基因型之間的顯著差異（兩尾曼惠特尼檢驗(yàn)抒蚜，P?<0.0001）掘鄙。?n.s，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異嗡髓。對(duì)于種子區(qū)域操漠，WT與ran1-3，ran2-1和ran3-1的P值分別為0.000193饿这，<1×10-15和0.461颅夺。種子周長(zhǎng)分別為0.0463、4.378×10-7和0.988蛹稍；種子長(zhǎng)度分別為0.0333吧黄、0.800和2.43×10-6;種子寬度分別為0.000409，<1×10-15和0.000164唆姐。

為了研究RAN蛋白在TFL1上可能的冗余效應(yīng)拗慨，我們創(chuàng)建了gDN-ran2-3FLAG轉(zhuǎn)基因株系，在該株系中奉芦，RAN2的27個(gè)殘基上的蘇氨酸 (T)突變?yōu)樘於０罚∟）與3FLAG翻譯的RAN2基因組片段融合赵抢。這產(chǎn)生了RAN2的顯性陰性版本(DN-ran2)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8a)，

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8?|?gDN-ran2-3FLAG（gDN）和TFL1：3FLAG-DN-ran2（TFL1：DN）轉(zhuǎn)基因植物的種子大小表型声功。?a烦却，b，gDN（a）或TFL1：DN（b）轉(zhuǎn)基因株系中DN-ran2蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析先巴。使用抗FLAG抗體分析了從長(zhǎng)角果中提取的總蛋白其爵。星號(hào)表示非特異性條帶冒冬。

如前所述，該版本阻斷了野生型RAN蛋白與GTP結(jié)合的正常功能摩渺。此外简烤，我們還在TFL1中使用的TFL1調(diào)控序列GUS(圖1a)驅(qū)動(dòng)下，生成了表達(dá)帶有3flag標(biāo)記的DN-ran2的TFL1: 3flag -DN-ran2轉(zhuǎn)基因植株(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8b)摇幻，以測(cè)試RAN蛋白對(duì)TFL1的原位效應(yīng)横侦。

值得注意的是，gDN-ran2-3FLAG和TFL1:3FLAG-DN-ran2轉(zhuǎn)基因株系均與tfl1-20的主要種子大小參數(shù)相關(guān)绰姻，產(chǎn)生的種子比RAN1-3的單突變體和雙突變體大得多(圖4c和5a枉侧，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5e和8c)。

c狂芋，野生型（WT）榨馁，tfl1-20，gDN银酗，TFL1：DN和tfl1-20?TFL1：DN植物的成熟干種子的比較。比例尺徒像，500μm黍特。

與tfl1-20一樣，4個(gè)DAP的gDN-ran2-3FLAG和TFL1:3FLAG-DN-ran2也檢測(cè)到種子腔擴(kuò)大的表型(圖5b,c)锯蛀。

b灭衷，從3到5?DAP，WT旁涤，tfl1-20翔曲，gDN，TFL1：DN和tfl1-20?TFL1：DN的整粒種子的DIC顯微鏡檢查劈愚。比例尺瞳遍，100μm。?c菌羽，在3–5?DAP時(shí)掠械，WT，tfl1-20注祖，gDN猾蒂，TFL1：DN和tfl1-20?TFL1：DN的種子腔面積的比較。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢查隨機(jī)選擇的種子（WT種子分別在3–5?DAP時(shí)是晨，n?=?19肚菠、18和24；?tfl1-20種子在3–5?DAP中罩缴，n?=?14蚊逢、13和20层扶；?gDN種子在3–5?DAP，n?=?24时捌、12和16怒医；?TFL1：DN種子在3–5?DAP，n?=?25奢讨、11和19稚叹；?tfl1-20?TFL1：DN種子在3–5?DAP，n?=?16拿诸、12和19）扒袖。值是平均值±s.d。每天的WT平均值設(shè)置為100％亩码。星號(hào)表示野生型植物與其他基因型之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（雙尾t檢驗(yàn)季率，P?<0.01）。在3?DAP時(shí)描沟，WT與tfl1-20飒泻，gDN，TFL1：DN和tfl1-20?TFL1：DN的P值分別為0.141吏廉、0.0937泞遗、0.916和0.503。在4?DAP時(shí)分別為4.12×10-3席覆、1.57×10-4史辙、1.27×10-4和7.07×10-4;在5?DAP時(shí)分別為9.33×10-13、7.27×10-9佩伤、8.16×10-10和7.05×10-8聊倔。

此外，與野生型種子相比生巡，在4 DAP時(shí)耙蔑，大多數(shù)gDN-ran2- 3FLAG和TFL1:3FLAG-DN-ran2種子并沒(méi)有發(fā)生胚乳細(xì)胞化(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8d,e)，

d孤荣，通過(guò)共聚焦顯微鏡比較在4?DAP下清除的WT纵潦，tfl1-20，gDN垃环，TFL1：DN和tfl1-20?TFL1：DN的整粒種子的外圍胚乳發(fā)育邀层。通過(guò)戊二醛處理產(chǎn)生自發(fā)熒光（綠色熒光）信號(hào)。箭頭指示胚乳細(xì)胞化過(guò)程中的新細(xì)胞壁遂庄。合并寥院，合并綠色熒光和明場(chǎng)圖像。比例尺涛目，50μm秸谢。?a-d中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)了3次凛澎，結(jié)果相似。

e估蹄，通過(guò)共聚焦顯微鏡檢查塑煎，在4?DAP時(shí)WT，tfl1-20臭蚁，gDN最铁，TFL1：DN和tfl1-20?TFL1：DN中具有合胞體或細(xì)胞化的外圍胚乳的種子百分比。檢查了每種基因型從10個(gè)以上角果中隨機(jī)選擇的種子垮兑。

說(shuō)明RANs的負(fù)作用也會(huì)影響胚乳細(xì)胞化冷尉，從而產(chǎn)生大的種子。值得注意的是系枪，雖然gTFL1-3HA和gTFL1-GFP完全挽救了tfl1-20的種子大小表型(圖1e)雀哨，但在tfl1-20 gtfl1 - 3flag - dn -ran2背景下，這種拯救完全消失私爷，因?yàn)閠fl1-20 gTFL1-GFP tfl1- 3flag - dn -ran2和tfl1-20 gTFL1-GFP tfl1- 3flag - dn -ran2仍能產(chǎn)生較大的種子雾棺。這些結(jié)果表明，TFL1在控制胚乳細(xì)胞化和種子大小方面的作用取決于RAN蛋白的活性衬浑。

為了研究RAN蛋白如何影響TFL1在種子發(fā)育中的作用捌浩，我們對(duì)ran2- gRAN2-3FLAG和gDN-ran2-3FLAG角狀細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞分離分析，發(fā)現(xiàn)RAN2-3FLAG及其顯性陰性的DN-ran2版本均定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖5d,e)嚎卫。

d–f嘉栓，通過(guò)特定基因型在4?DAP上的長(zhǎng)角果的細(xì)胞分級(jí)分析顯示宏榕，RAN2（d）拓诸，DN-ran2（e）和TFL1（f）的亞細(xì)胞定位。分別使用抗FLAG或抗HA抗體進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析麻昼，以檢查這些片段的核（N）或胞質(zhì)（C）組分中的RAN2奠支，DN-ran2和TFL1蛋白。與細(xì)胞質(zhì)分?jǐn)?shù)相比抚芦，核分?jǐn)?shù)過(guò)量十倍倍谜。用麗春紅S染色的RbcL和使用抗組蛋白3（H3）的免疫印跡分析分別用作細(xì)胞溶質(zhì)和核級(jí)分的指標(biāo)。

無(wú)論TFL1- 20 gTFL1-3HA中是否存在野生型RAN2(圖3f)叉抡，或TFL1- 20 gTFL1-3HA中是否存在顯性陰性的DN-ran2(圖5f)尔崔， TFL1- 3ha都只存在于細(xì)胞質(zhì)中，這表明RAN蛋白不太可能影響TFL1的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)褥民。相比之下季春，tfl1-20 gTFL1-GFP TFL1:3FLAG-DN-ran2的共聚焦分析顯示，TFL1-GFP在過(guò)渡階段局限在合點(diǎn)胚乳的細(xì)胞質(zhì)中(圖5g和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9c)

g消返，通過(guò)冷凍切片以4?DAP將tfl1-GFP定位在tfl1-20?gTFL1-GFP?TFL1：DN種子中载弄。?TFL1-GFP信號(hào)可在合點(diǎn)端（CZE耘拇；左兩幅圖）及其特寫(xiě)視圖（右兩幅圖）中觀察到。請(qǐng)注意宇攻，SPE中不存在TFL1-GFP惫叛。合并，合并GFP和明場(chǎng)圖像逞刷。比例尺為40μm（左）和10μm（右）嘉涌。

c，通過(guò)冷凍切片以4?DAP將TFL1-GFP定位在另一tfl1-20?gTFL1-GFP?TFL1：DN種子中亲桥。?TFL1-GFP信號(hào)可在合點(diǎn)端（CZE洛心；左圖和中圖）及其特寫(xiě)視圖（右兩圖）中觀察到。注意题篷，所有合胞體周圍胚乳（SPE）中都不存在TFL1-GFP词身。合并，合并GFP和明場(chǎng)圖像番枚。比例尺40μm（左）和10μm（右）

法严，而不局限在SPE中，如tfl1-20 gTFL1-GFP所示(圖3d)葫笼。這表明顯性陰性的DN-ran2抑制了TFL1從合點(diǎn)胚乳向SPE的轉(zhuǎn)運(yùn)深啤。總的來(lái)說(shuō)路星，這些觀察結(jié)果表明RAN蛋白與合點(diǎn)胚乳中的TFL1相互作用溯街，并決定其轉(zhuǎn)運(yùn)到SPE，從而影響種子發(fā)育過(guò)程中胚乳細(xì)胞化的及時(shí)進(jìn)行洋丐。

TFL1與ABI5相互作用呈昔，影響ABI5在種子發(fā)育過(guò)程中的穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步闡明TFL1是如何影響胚乳細(xì)胞化的友绝，我們?cè)噲D評(píng)估TFL1的功能是否與IKU通路中的調(diào)節(jié)因子相關(guān)堤尾。既往研究表明，ABI5直接抑制SHB1表達(dá)迁客，通過(guò)SHB1- mini3 - IKU2途徑影響胚乳細(xì)胞化郭宝。ABI5的功能喪失相應(yīng)表現(xiàn)為大的種子表型(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10a)。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10?|檢查與ABI5有關(guān)的種子大小表型和基因表達(dá)掷漱。?a粘室，tfl1-20，abi5-1和tfl1-20?abi5-1種子大小參數(shù)的定量分析卜范。箱形圖顯示了不同基因型（WT衔统，n?=?198；?tfl1）的種子大小參數(shù)（面積，周長(zhǎng)缰冤，長(zhǎng)度和寬度）的中位數(shù)（線）犬缨，四分位間距（框）和晶須（擴(kuò)展了四分位間距的1.5倍）?-20，n?＝?133棉浸；?abi5怀薛，n?＝?110；?tfl1-20abi5迷郑，n?＝?138）枝恋。顯示了相對(duì)于野生型（WT）植物的平均值設(shè)置為100％的突變體種子參數(shù)的百分比變化（％）。每個(gè)框上方顯示了突變體相對(duì)于WT的百分比增加嗡害。星號(hào)表示野生型植物和其他突變體之間的顯著差異（兩尾曼惠特尼檢驗(yàn)焚碌，P?<0.001）。?WT和abi5之間的種子面積霸妹，周長(zhǎng)十电，長(zhǎng)度和寬度的P值分別為1.48×10-12、1.74×10-8叹螟、1.55×10-11和1.78×10-4鹃骂，而WT與abi5之間的P值tfl1-20或tfl1-20?abi5均小于1×10-15。

ABI5在所有檢測(cè)的組織中廣泛表達(dá)罢绽，包括2 - 7 DAP的長(zhǎng)角果(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10b)畏线，

b，定量分析授粉后2至7天（DAP良价，下圖）在各種組織（上圖）或正在形成的角果中ABI5表達(dá)寝殴。?OF，開(kāi)花明垢；?IS蚣常，花序莖；?RL袖外，蓮座葉史隆；?Rt魂务，根曼验；sil，長(zhǎng)角果粘姜；?CL鬓照，莖生葉；?FB孤紧，花蕾豺裆。將結(jié)果相對(duì)于作為內(nèi)部對(duì)照的U-BOX基因的表達(dá)水平進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。下部面板中的表達(dá)水平顯示為相對(duì)于設(shè)置為1的2?DAP水平的相對(duì)值。值是三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD臭猜。

而ABI5- gus融合蛋白在4 DAP的過(guò)渡階段在整個(gè)種子中表達(dá)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10c)挠进。

c斤儿，在4DAP時(shí)，gABI5-GUS和tfl1-20gABI5-GUS種子之間的GUS染色信號(hào)的比較。通過(guò)在終止密碼子TAA之前將GUS基因與4.1-kb?ABI5基因組片段翻譯融合產(chǎn)生了gABI5-GUS構(gòu)建體局蚀。比例尺，50μm馏予。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地重復(fù)了三遍乐尊，結(jié)果相似。

此外劫灶，有報(bào)道稱FL1與FD蛋白相互作用裸违，F(xiàn)D蛋白是一組堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)轉(zhuǎn)錄因子中ABI5的同源物(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10d)。

d本昏，A組基本亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育分析供汛。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)是由MEGA4使用鄰居加入算法生成的。分支上的數(shù)字表示1,000個(gè)重復(fù)中的引導(dǎo)程序值涌穆。?ABI5和FD用紅點(diǎn)標(biāo)記紊馏。

這些結(jié)果促使我們研究TFL1是否與ABI5相互作用調(diào)節(jié)種子大小。

下拉檢測(cè)顯示His-ABI5結(jié)合到vitro翻譯的MBP- tfl1上蒲犬，但不結(jié)合MBP本身(圖6a)朱监。

圖6?|?TFL1通過(guò)影響ABI5穩(wěn)定性來(lái)部分調(diào)節(jié)種子大小。?a原叮，TFL1和ABI5之間相互作用的體外下拉試驗(yàn)赫编。?MBP和MBP-TFL1用作誘餌，并使用抗MBP抗體通過(guò)免疫印跡分析檢查相應(yīng)的上樣對(duì)照（下圖）奋隶。獵物蛋白His-ABI5的輸入及其相應(yīng)的下拉信號(hào)通過(guò)使用抗His抗體的免疫印跡分析進(jìn)行檢查（上圖）擂送。

檢查TFL1之間的交互,在擬南芥ABI5中,我們生成gABI5 - 3FLAG轉(zhuǎn)基因植物中4.1 kb ABI5基因組片段,包括2.3 kb 5上游序列,1.6 kb ABI5編碼區(qū)轉(zhuǎn)化融合3FLAG,和216 - bp 3下游序列,救出abi5-1的大型種子表型。gABI5-3FLAG tfl1-20 gTFL1-3HA與tfl1-20 gTFL1-3HA基因雜交產(chǎn)生的gABI5-3FLAG tfl1-20 gTFL1-3HA 長(zhǎng)角果總蛋白提取物的CoIP分析顯示唯欣，ABI5-3FLAG與TFL1-3HA在體內(nèi)相互作用(圖6b)嘹吨，

b，CoIP顯示的擬南芥中TFL1-3HA和ABI5-3FLAG之間的體內(nèi)相互作用境氢。用抗FLAG抗體免疫沉淀來(lái)自tfl1-20?gTFL1-3HA或gABI5-3FLAG?tfl1-20?gTFL1-3HA的年輕長(zhǎng)角果的總蛋白提取物蟀拷。使用抗HA（上圖）或抗FLAG（下圖）抗體通過(guò)免疫印跡分析檢查輸入的和共免疫沉淀的蛋白質(zhì)。

說(shuō)明了ABI5-3FLAG與TFL1-3HA的相互作用萍聊。

值得注意的是问芬，我們發(fā)現(xiàn)在4 DAP時(shí)，與野生型種子相比寿桨，tfl1-20角果中ABI5-3FLAG蛋白水平顯著降低(圖6c)此衅，這與tfl1-20相對(duì)于野生型種子的ABI5-GUS信號(hào)較弱一致(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10c)。

c，在野生型（WT）或tfl1-20背景下的gABI5-3FLAG中ABI5降解的體內(nèi)測(cè)定挡鞍。使用抗FLAG抗體通過(guò)免疫印跡分析檢查了在4?DAP時(shí)從長(zhǎng)角果中提取的總蛋白骑歹。每個(gè)泳道下方的數(shù)字表示相對(duì)于gABI5-3FLAG（WT）中設(shè)置為1.00的值的ABI5蛋白水平，均針對(duì)用Ponceau?S染色的RbcL進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化墨微。星號(hào)表示非特異性條帶

在植物細(xì)胞ABI5蛋白質(zhì)通過(guò)26 s蛋白酶體途徑退化,然后測(cè)試TFL1之間的交互和ABI5是否可能影響ABI5-3FLAG gABI5-3FLAG穩(wěn)定和tfl1-20 gABI5-3FLAG長(zhǎng)角果對(duì)待環(huán)己酰亞胺(一種蛋白質(zhì)合成抑制劑)在沒(méi)有或存在MG132 (26 s蛋白酶體抑制劑)陵刹。在野生型和tfl1-20背景下，環(huán)已酰亞胺和MG132聯(lián)合處理3小時(shí)欢嘿，均顯著提高了ABI5-3FLAG的穩(wěn)定性衰琐，且tfl1-20與野生型蝶骨相比，其ABI5-3FLAG水平下降的幅度明顯小于單獨(dú)處理環(huán)已酰亞胺(圖6d)炼蹦。

d羡宙，在MG132或環(huán)己酰亞胺（CHX）處理下，在野生型（WT）或tfl1-20背景下的gABI5-3FLAG中ABI5降解的體內(nèi)測(cè)定掐隐。在50μMCHX加0.012％Silwet?L-77的存在下狗热，在不使用或使用50μMMG132的情況下，對(duì)4?DAP的長(zhǎng)角果進(jìn)行處理虑省，并在指定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行收集匿刮。每個(gè)泳道下方的數(shù)字表示相對(duì)于gABI5-3FLAG（WT）中處理1小時(shí)（不使用MG132或使用MG132）的值設(shè)置為1.00的ABI5蛋白水平，所有這些均針對(duì)Ponceau?S染色的RbcL進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化探颈。特定的樂(lè)隊(duì)熟丸。?a-d中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)了3次，結(jié)果相似伪节。

這些觀察結(jié)果表明光羞，TFL1和ABI5的相互作用至少影響了26s蛋白酶體途徑介導(dǎo)的ABI5的穩(wěn)定性。

這些圖我都看得不太懂怀大，不會(huì)看圖是閱讀文獻(xiàn)的硬傷纱兑，然而不會(huì)看圖的主要原因是不知道文章所提到的分析方法，我要想個(gè)辦法化借，把這些常用的分析方法學(xué)習(xí)一下潜慎，要不然一碰到這些文章就一知半解。