帕金森才凇（parkinson’s disease, PD）是繼阿爾茨海默病（Alzheimer's disease沛慢，AD）之后第二常見的一種神經(jīng)退行性疾病，多見于中老年人团甲，患者主要表現(xiàn)為震顫往枣、行動遲緩伐庭、肌強(qiáng)直等運(yùn)動癥狀和一系列非運(yùn)動癥狀。其目前的治療方案只能緩解患者的癥狀霸株，并不能阻止PD的進(jìn)展集乔，而PD是一種進(jìn)行性惡化的疾病，因此找到能阻止PD進(jìn)展的治療方案十分重要尤溜。
2018年11月2日美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病和干細(xì)胞研究中心Valina L. Dawson和Ted M. Dawson團(tuán)隊(duì)在Science雜志發(fā)表了題為Poly(ADP-ribose) drives pathologic α-synuclein neurodegeneration in Parkinson’s disease的研究論文汗唱，發(fā)現(xiàn)Poly(ADP-ribose)可以增強(qiáng)α-synuclein毒性，促進(jìn)α-synuclein聚集授霸，并參與病理性α-synuclein介導(dǎo)的細(xì)胞損傷际插，促進(jìn)PD進(jìn)展。這一發(fā)現(xiàn)或許能為阻止PD的進(jìn)展提供治療靶點(diǎn)[1]辛辨。Science雜志同時對此研究結(jié)果發(fā)表了評論文章[2]瑟枫。
有沒有覺得哪個分子很眼熟？對了榜旦，Poly(ADP-ribose) 就是PAR景殷，上一篇文章也有提到哦。
現(xiàn)在咱們一起學(xué)習(xí)下這篇文章吧咐旧。
背景介紹
帕金森病和α-突觸核蛋白
帕金森病是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病绩蜻，患者主要表現(xiàn)為靜止性震顫、行動遲緩伊约、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)障礙四大運(yùn)動癥狀，有的還伴有焦慮屡律、抑郁、睡眠障礙超埋、自主神經(jīng)功能障礙、認(rèn)知障礙等非運(yùn)動癥狀媒惕。
帕金森病主要的病理改變是中腦黑質(zhì)部多巴胺（dopamine, DA）能神經(jīng)元減少来庭，殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，即路易小體（Lewy body）面睛。纖維樣的α-突觸核蛋白（α-synuclein, α-syn）是路易小體的主要成分尊搬。
α-syn是在大腦中廣泛表達(dá)的一種突觸前蛋白佛寿，生理狀態(tài)下呈可溶的蛋白單體形式但壮，當(dāng)其聚集成不溶的纖維樣寡聚體，則具有致病性弹渔，可引起神經(jīng)元細(xì)胞死亡。病理性的α-syn可以像朊病毒一樣在細(xì)胞間傳播肢专，促進(jìn)PD進(jìn)展焦辅。
然而是什么引起α-syn的病理性聚集呢？病理性聚集的α-syn又是如何引起細(xì)胞死亡的剃根？這些都還不清楚前方。
PAR與PARP1
Poly(ADP-ribose) （PAR）是Poly(ADP-ribose) polymerase-1（PARP-1）以NAD+為底物合成的產(chǎn)物廉油。細(xì)胞核PARP-1和PAR的主要功能是發(fā)現(xiàn)各種原因引起的DNA損傷抒线，并啟動相應(yīng)的DNA修復(fù)機(jī)制。
PARP-1依賴性細(xì)胞死亡
PARP-1依賴性細(xì)胞死亡（Parthanatos）是一種由于PARP-1激活引起的程序性細(xì)胞壞死形式十兢，Parthanatos是根據(jù)“par”（PARP-1的酶學(xué)產(chǎn)物）+ “thanatos”（希臘語的死亡之神）而命名摇庙。
Parthanatos這種細(xì)胞死亡形式廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病等疾病中宵呛。
因?yàn)镻arthanatos中PARP-1和PAR可引起細(xì)胞死亡夕凝，故作者擬探究PARP-1和PAR是否參與PD中病理性α-syn引起的DA神經(jīng)元丟失。
方法與結(jié)果
1?α-syn?PFF的神經(jīng)毒性依賴于PARP-1
α-syn預(yù)制纖維（a-syn preformed fibrils, α-syn PFF）是一種體外重組的α-syn逮矛，能夠像體內(nèi)的α-syn一樣聚集成纖維转砖，并能像朊病毒一樣在神經(jīng)元細(xì)胞間傳播，當(dāng)其被注射進(jìn)小鼠的腦內(nèi)晋控，其S129位點(diǎn)可發(fā)生磷酸化姓赤，形成p-α-syn（病理性α-syn的一個標(biāo)志），因此是研究α-syn的一個良好模型蝌焚。
為了探究α-syn PFF能否激活PARP-1誓斥，作者用α-syn PFF處理鼠的原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，WB檢測PAR的變化红碑，發(fā)現(xiàn)第3-7d PAR的表達(dá)逐漸增加直至最高峰，并維持增加狀態(tài)直到第14d羡鸥。
PI染色發(fā)現(xiàn)PAR的增加伴隨著細(xì)胞死亡的增加。
用三種PARP抑制劑（ABT-888, AG-014699, BMN 673）處理細(xì)胞衷旅，則發(fā)現(xiàn)可以阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞PARP激活和細(xì)胞死亡纵朋。
α-syn PFF處理細(xì)胞能夠促進(jìn)α-syn進(jìn)行 S129位點(diǎn)的磷酸化形成p-α-syn聂薪，并促進(jìn)水溶性α-syn形成不溶性α-syn，兩者都是病理性α-syn的特征仁锯。而PARP抑制劑能夠明顯阻止這些效應(yīng)翔悠。
敲低或敲除PARP-1亦能明顯阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的PARP激活和細(xì)胞凋亡。
敲除PARP-1能夠阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的α-syn的磷酸化及不溶性α-syn的形成。
用廣譜的caspase抑制劑Z-VAD能部分減輕α-syn PFF的毒性戚炫，而壞死性凋亡抑制劑Nec-1和自噬抑制劑3-MA無法減輕α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，PARP抑制劑ABT-888則能夠阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡施掏，說明α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要依賴于PARP-1，即parthanatos七芭，而不是通過激活細(xì)胞凋亡、壞死或自噬预明。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲除PARP-1或藥物抑制PARP-1能夠減少p-α-syn的形成，這種減少會不會是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)吞的α-syn PFF減少呢窗慎？
作者富集細(xì)胞內(nèi)吞體卤材，檢測PARP-1敲除和藥物抑制條件下內(nèi)吞體內(nèi)biotin標(biāo)記的α-syn PFF含量，發(fā)現(xiàn)均與對照組無明顯差異术吗，說明PARP-1不影響細(xì)胞對α-syn PFF的攝入帆精。
背景介紹中提到α-syn PFF能像朊病毒般在細(xì)胞間傳播隘蝎，促進(jìn)PD進(jìn)展襟企，那它的這種細(xì)胞間傳播的特性是否也依賴于PARP-1呢？
作者進(jìn)行了微流控室實(shí)驗(yàn)顽悼，首先通過微流體裝置將α-syn PFF加入到chamber 1 (C1)，第14d再檢測chamber 2 (C2) 和chamber 3 (C3)中是否出現(xiàn)α-syn冰评，即α-syn PFF是否有傳播功能木羹。
結(jié)果顯示W(wǎng)T神經(jīng)元組第14d可在C2和C3中可檢測到p-α-syn， 而PARP-1 KO組基本檢測不到务荆，說明α-syn PFF的傳播功能也依賴于PARP-1。
2?α-syn PFF通過NO誘導(dǎo)的DNA損傷激活PARP-1
第一部分已經(jīng)證明α-syn PFF能夠激活PARP-1，并通過PARP-1發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用结啼，那么α-syn PFF是如何激活PARP-1的呢？
作者發(fā)現(xiàn)用α-syn PFF處理神經(jīng)元細(xì)胞或?qū)⑵渲苯幼⑸涞叫∈竽X內(nèi)郊愧，可引起細(xì)胞的NO水平增加及DNA損傷增加井佑。
用NO合成酶抑制劑L-NAME處理神經(jīng)元細(xì)胞或小鼠大腦，則可以抑制α-syn PFF誘導(dǎo)的NO合成焦蘑、DNA損傷及PARP-1激活盒发。
此外NO合成酶抑制劑還可以抑制α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
以上說明α-syn PFF通過激活NO合成酶详羡，引起DNA損傷，激活PARP-1实柠，通過parthanatos引起細(xì)胞死亡。
3?α-syn?PFF通過PAR介導(dǎo)DA神經(jīng)元丟失
前面已經(jīng)證明α-syn PFF通過parthanatos引起細(xì)胞死亡草则，那么這一通路會不會跟PD中DA神經(jīng)元的丟失有關(guān)？
向小鼠一側(cè)的紋狀體內(nèi)注射α-syn PFF可激活PARP-1源内，增加PAR水平份殿，而敲除PARP-1或用PARP-1抑制劑處理后，可阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的PAR水平增加颂斜，減輕α-syn PFF的神經(jīng)毒性。
同時拾枣，注射α-syn PFF 6個月后，WT小鼠注射側(cè)DA神經(jīng)元減少約50%司蔬，而PARP-1敲除組和PARP-1抑制劑處理組小鼠的DA神經(jīng)元無明顯減少凭语。
酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）是DA合成的關(guān)鍵酶偶器，作者發(fā)現(xiàn)用α-syn PFF處理WT小鼠后缝裤，TH和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)子（DA transporter, DAT）水平均明顯降低，而敲除或抑制PARP-1憋飞，可阻止該現(xiàn)象。
此外，α-syn PFF處理的WT小鼠紋狀體DA和DA代謝產(chǎn)物含量明顯減少厘擂，PARP-1 KO組和PARP-1抑制劑處理組無明顯變化。
向WT小鼠大腦注射α-syn PFF可引起小鼠爬桿試驗(yàn)（pole test）時間延長，握力試驗(yàn)（grip strength）力量降低安皱，敲除PARP-1或PARP-1抑制劑處理則可緩解α-syn PFF引起的PD運(yùn)動癥狀。
4?PAR促進(jìn)α-syn纖維化
既往研究顯示PAR能夠?qū)е鹿逃袩o序蛋白液體分層，引起其聚集疆柔，那么PAR能否促進(jìn)α-syn聚集呢？
在加或不加PAR的條件下模叙，作者觀察α-syn單體孵育一段時間后聚合物的生成情況彬犯，發(fā)現(xiàn)不加PAR時，α-syn單體孵育72h才出現(xiàn)不同分子量的α-syn聚合物谐区，而加了PAR，24h即出現(xiàn)不同分子量的α-syn聚合物昭抒。
不同孵育溫度或不同濃度的PAR可引起α-syn纖維化效率的不同（原文Fig. S7A-C）炼杖。
熒光染料硫黃素T（thioflavin T fluorescence, ThT）可用于淀粉樣纖維聚集過程的定性定量監(jiān)測。通過ThT熒光監(jiān)測可見PAR能明顯促進(jìn)α-syn聚集黔衡。
透射電鏡觀察到不加PAR時，α-syn單體孵育72h才出現(xiàn)α-syn寡聚體纖維夜牡，而加了PAR侣签，12h即可看到α-syn寡聚體的形成。
因?yàn)镻AR是個高度帶負(fù)電的分子，為排除PAR引起的α-syn聚集是由于蛋白間的電荷相互作用冗尤，作者研究了同樣帶負(fù)電的PolyA分子對α-syn聚集的影響胀溺，發(fā)現(xiàn)其并沒有顯著促進(jìn)α-syn聚集。
Overlay assay顯示PAR與α-syn之間有相互作用背零，而ADP ribose（ADPr）單體與α-syn之間沒有相互作用无埃，也不影響α-syn的聚集毛雇。
PARP-1能夠促使蛋白發(fā)生ADP核糖基化闹炉，那么它會使α-syn發(fā)生核糖基化嗎？
體外核糖基化實(shí)驗(yàn)（IVRA）顯示不會渣触。
Overlay assay和Co-IP均顯示α-syn與PAR之間存在相互作用，作者運(yùn)用deletion analysis和Co-IP確認(rèn)α-syn通過其氨基端與PAR作用晾腔。
為了探究內(nèi)源性的PAR生成是否能促進(jìn)α-syn聚集剔应，作者用N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)處理過表達(dá)α-syn的原代鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NMDA可激活PARP峻贮，引起α-syn聚集应闯，而敲除PARP-1或用PARP-1抑制劑處理后，α-syn不再聚集船万。
在過表達(dá)α-syn的PARP-1 WT型和PARP-1 KO型細(xì)胞中外源給予PAR，均可rescue α-syn的聚集态贤。
在過表達(dá)WT型α-syn和α-syn A53T的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y中，給予PARP激活劑MNNG可促進(jìn)α-syn聚集箱吕，敲除PARP-1或給予PARP-1抑制劑后，α-syn聚集減少茬高，外源補(bǔ)充PAR則可同樣rescue PARP-1敲除或抑制引起的α-syn聚集減少。
5?PAR增強(qiáng)α-syn?PFF的體外毒性
前面證明了PAR與α-syn PFF結(jié)合，那么這種結(jié)合會改變α-syn PFF的生物物理屬性嗎刑棵？
作者用蛋白酶K（proteinase K）消化α-syn PFF處理的和PAR-α-syn PFF處理的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PAR-α-syn PFF處理的細(xì)胞更能抵抗PK的消化胡陪，提示PAR-α-syn PFF可能折疊的更緊密。
第一部分已經(jīng)證明了α-syn具有神經(jīng)毒性片橡，作者大致重復(fù)第一部分的實(shí)驗(yàn)乔询，如PAR促進(jìn)細(xì)胞死亡（原文Fig. S10）肆糕、促進(jìn)p-α-syn生成妒穴、促進(jìn)不溶性α-syn生成冒版、促進(jìn)α-syn的內(nèi)吞和傳播（原文Fig. S11）橡疼，證明PAR能明顯增強(qiáng)α-syn的體外毒性揭朝。
6?PAR增強(qiáng)α-syn?PFF的體內(nèi)毒性
為了探究PAR對α-syn PFF體內(nèi)毒性的影響敌卓，作者將α-syn PFF或PAR–α-syn PFF注射到小鼠一側(cè)的紋狀體內(nèi)伶氢，發(fā)現(xiàn)注射PAR–α-syn PFF組更早出現(xiàn)DA神經(jīng)元的丟失瘪吏，更早形成p-α-syn蜗巧，且p-α-syn的水平明顯高于注射α-syn PFF組。
此外蓝丙，與α-syn PFF相比，PAR–α-syn PFF明顯促進(jìn)DA及其代謝產(chǎn)物的丟失（原文Fig. S13）渺尘，TH和DAT水平下降（原文Fig. S14）说敏，小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)和握力實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)變得更差。
7?PD患者腦脊液PAR水平增加
作者檢測兩個獨(dú)立隊(duì)列的PD患者和對照者的腦脊液（CSF）的PAR水平俏蛮，均發(fā)現(xiàn)PD患者CSF的PAR水平明顯增加，且PAR的水平與疾病持續(xù)時間和Hoehn & Yahr分期呈正相關(guān)争涌。
此外，作者發(fā)現(xiàn)PD患者黒質(zhì)（substantia nigra, SN）的PAR水平也明顯增加忘瓦，這一點(diǎn)與既往的研究結(jié)果一致引颈。
結(jié)論
病理性α-syn通過激活NO合成酶，誘導(dǎo)DNA損傷逼泣，激活PARP-1，產(chǎn)生的PAR促進(jìn)病理性α-syn的生成拉庶，通過parthanatos引起細(xì)胞死亡嗜憔。敲除或降低PARP-1可抑制病理性α-syn的毒性吉捶。PAR可在體內(nèi)和體外增強(qiáng)病理性α-syn的毒性皆尔，形成前饋循環(huán)。PD患者的腦脊液和黒質(zhì)的PAR含量明顯增加慷蠕。以上提示PARP-1的激活參與PD的進(jìn)展，因此抑制PARP-1的激活有望阻止PD中DA神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失流炕。
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學(xué)霸總結(jié)
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參考文獻(xiàn)
[1]?Kam TI, et al. Poly(ADP-ribose) drives pathologic alpha-synuclein neurodegeneration in Parkinson's disease [J]. Science (New York, NY), 2018, 362(6414).
[2]?Brundin P, et al. Cancer enzyme affects Parkinson's disease [J]. Science (New York, NY), 2018, 362(6414): 521-522.
