生信小課堂

背景：長(zhǎng)鏈非編碼RNA相關(guān)免疫基因( lrRIGs )在肺腺癌( LUAD )的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。然而阱缓，基于lrRIGs的可靠預(yù)后特征尚未確定祭犯。

方法：作者使用TCGA 數(shù)據(jù)庫篩選了與LUAD預(yù)后相關(guān)的lrRIGs最盅，然后通過生物信息學(xué)方法建立了一個(gè)由9個(gè)預(yù)后基因構(gòu)成的標(biāo)簽惹想。基于該基因標(biāo)簽的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分被用于將LUAD患者分為低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)組叫倍。后者被證實(shí)具有明顯更差的總生存期( O.S. )。使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他獨(dú)立預(yù)后因素開發(fā)了諾姆圖，在預(yù)測(cè)LUAD患者的OS率方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。

結(jié)果：作者觀察到不同免疫細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)以及對(duì)免疫治療和化療的反應(yīng)在低危組和高危組之間存在顯著差異司倚。

結(jié)論：總的來說盒粮，基于該基因特征的分層可以用于指導(dǎo)LUAD患者更好的治療管理和改善預(yù)后讼油。

****歡迎做類似的生信分析！****
研究結(jié)果

LUAD中基于lrRIGs的預(yù)后模型的開發(fā)

作者從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了LUAD的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)忘苛，包括54個(gè)正常樣本和497個(gè)腫瘤樣本。然后逗威，根據(jù)Ensemble中的基因轉(zhuǎn)移格式( GTF )文件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋鞠柄，使用R中的cor. test進(jìn)行相關(guān)性分析侧馅，| correlation coefficient | > 0.4小渊，P < 0.01，對(duì)lncRNA與2483個(gè)免疫相關(guān)基因進(jìn)行共表達(dá)分析锨络。共有889個(gè)被鑒定為lrRIGs肤粱，329個(gè)為差異表達(dá)的lrRIGs，其中123個(gè)下調(diào)，206個(gè)上調(diào)(圖1a )誓篱。為了進(jìn)一步探索329個(gè)lrRIGs在LUAD中的潛在預(yù)測(cè)價(jià)值，進(jìn)行了單變量Cox回歸分析。在風(fēng)險(xiǎn)比( Hazard Ratio，HR )≠1拆宛，P < 0.01時(shí)诬乞，從TCGA數(shù)據(jù)庫中確定27個(gè)基因?yàn)長(zhǎng)UAD患者發(fā)生OS的預(yù)后基因措伐。接下來，使用具有十倍交叉驗(yàn)證的lasso回歸，從最小偏似然偏差中獲得最優(yōu)lambda值岖研，該值與27個(gè)與O.S (圖1b , c)顯著相關(guān)的預(yù)后基因中的15個(gè)相關(guān)窥摄。最后玻侥，作者將TCGA _ LUAD數(shù)據(jù)庫作為訓(xùn)練集( n = 468)宣旱，GSE31210數(shù)據(jù)庫作為外部驗(yàn)證集( n = 226)叛薯。多因素Cox回歸分析觀察到9個(gè)基因構(gòu)建了LUAD的顯著預(yù)后特征：CD79A浑吟，INHA，SHC3耗溜，LIFR组力，TNFRSF11A，GPI抖拴，F(xiàn)2RL1燎字，SEMA7A和WFDC2(圖1d , e)腥椒。預(yù)后基因特征表示為risk Score = sum [基因表達(dá)量×系數(shù)]。

圖 1 根據(jù)差異表達(dá)的lncRNA相關(guān)免疫基因識(shí)別預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)基因并分析其表達(dá)情況

評(píng)估lrRIGs預(yù)后標(biāo)簽的性能

使用“survminer”R軟件包根據(jù)IrRIGs預(yù)后特征計(jì)算TCGA_LUAD數(shù)據(jù)集中每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分候衍。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組笼蛛。Kaplan-Meier分析表明，O.S.高風(fēng)險(xiǎn)組比低風(fēng)險(xiǎn)組更差（圖1）蛉鹿。2a; P<0.05）滨砍。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和存活狀態(tài)的分布繪制在圖1B中。2b妖异，顯示高風(fēng)險(xiǎn)患者的存活率較差惋戏。然后進(jìn)行ROC曲線分析，評(píng)估lrRIGs特征的預(yù)測(cè)能力随闺。在O.S的1年日川、3年和5年，lrRIGs風(fēng)險(xiǎn)特征的AUC分別為0.727矩乐、0.709和0.675(圖2c)龄句。最后，使用GSE31210數(shù)據(jù)庫和由GSE11969散罕、GSE13213分歇、GSE41271、GSE42127欧漱、GSE50081职抡、GSE68465和GSE72094組成的綜合數(shù)據(jù)集對(duì)lrRIGs風(fēng)險(xiǎn)特征進(jìn)行驗(yàn)證，其中包括1489例LUAD患者的生存數(shù)據(jù)误甚。作者以上述方式對(duì)LUAD患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和風(fēng)險(xiǎn)分組缚甩。相同的，在低風(fēng)險(xiǎn)組比在高風(fēng)險(xiǎn)組（圖2d窑邦，e擅威，g，h; P< 0.05）冈钦，生存分析觀察到OS顯著更長(zhǎng)郊丛。此外，ROC曲線的分析證明該九基因標(biāo)簽在上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中具有穩(wěn)健的預(yù)測(cè)能力（圖1B 2f瞧筛，i）厉熟。

圖 2 lrRIGs特征的預(yù)后性能。

預(yù)后標(biāo)記基因的表達(dá)水平和預(yù)后價(jià)值的驗(yàn)證

作者對(duì)這九個(gè)預(yù)后標(biāo)記基因進(jìn)行了外部驗(yàn)證较幌。GSE 31210和GSE 75037數(shù)據(jù)庫分析表明揍瑟，LUAD組織中INHA、TNFRSF 11 A乍炉、GPI月培、F2RL1嘁字、WFDC 2、CD 79 A和SEMA7A的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常肺組織（均P < 0.05）杉畜。而SHC3和LIFR在腫瘤組織中的表達(dá)水平較低。此外衷恭，通過蛋白質(zhì)印跡分析此叠，在30個(gè)匹配的臨床LUAD組織（T）和鄰近的非腫瘤組織（N）中進(jìn)一步證實(shí)了這9個(gè)標(biāo)簽基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此外随珠，坐著基于人類蛋白質(zhì)圖譜( HPA )數(shù)據(jù)庫的免疫組化數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析了預(yù)后特征基因的表達(dá)特征及其與肺腺癌的相關(guān)性灭袁。選擇GPI基因進(jìn)行后續(xù)的研究工作，因?yàn)镚PI在9個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因中具有最高的HR值窗看。結(jié)果顯示茸歧，GPI在正常肺組織和癌旁組織中的表達(dá)水平相對(duì)較低，而在非小細(xì)胞肺癌( non-small cell lung cancer显沈，NSCLC )組織和LUAD組織中有較高比例的高(非小細(xì)胞肺癌( NSCLC ) , 5 / 12 ; LUAD , 1 / 6)和中等( NSCLC , 6 / 12 ; LUAD , 4 / 6) GPI染色软瞎，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。隨后拉讯，使用Kaplan - Meier繪圖機(jī)分別通過Kaplan - Meier生存分析和log - rank檢驗(yàn)評(píng)估這些特征基因?qū)S和無復(fù)發(fā)生存期( RFS )的預(yù)測(cè)作用涤浇。結(jié)果顯示，INHA魔慷、GPI只锭、F2RL1、CD79A和SEMA7A的高表達(dá)以及SHC3和LIFR的低表達(dá)與LUAD 的OS和RFS縮短有關(guān)院尔。

lrRIGs標(biāo)簽與其他報(bào)道的基因標(biāo)簽的性能比較

為了進(jìn)一步評(píng)估lrRIGs標(biāo)簽的預(yù)測(cè)性能蜻展，作者選擇從Sun的[23]、Cao的[24]邀摆、Zhang的[25]和Li的[26]獲得的四個(gè)公開的基因標(biāo)簽進(jìn)行比較纵顾。根據(jù)這四個(gè)風(fēng)險(xiǎn)模型中對(duì)應(yīng)的基因，在訓(xùn)練隊(duì)列中使用相同的方法計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分隧熙。采用Kaplan-Meier生存分析和ROC曲線分析片挂。作者觀察到，在所有四種風(fēng)險(xiǎn)模型中贞盯，高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的預(yù)后差異是顯著的音念。然而，ROC分析顯示躏敢，1年闷愤、3年和5年0.S.分別為0.727、0.709和0.675件余。這些AUC顯著大于Sun讥脐、Cao遭居、Zhang和Li的基因簽名的AUC（圖2c）。此外旬渠，作者基于lrRIG的風(fēng)險(xiǎn)模型具有最高的C指數(shù)俱萍，為0.68。此外告丢，所有五個(gè)預(yù)后模型的RMS時(shí)間曲線進(jìn)一步證明枪蘑，該9-基因標(biāo)簽具有最大斜率，表明具有l(wèi)rRIGs預(yù)后標(biāo)志的LUAD存活的上級(jí)估計(jì)岖免。

預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床結(jié)局相關(guān)

作者使用單變量和多變量考克斯回歸分析臨床參數(shù)岳颇、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和OS之間的關(guān)系。(圖3a颅湘、B）话侧。結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是一個(gè)獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因素闯参，風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為1.341瞻鹏。 分期（HR = 1.486）和復(fù)發(fā)（HR = 1.901）顯示了相似的結(jié)果。年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義赢赊。

為了提高預(yù)測(cè)模型在LUAD中的準(zhǔn)確性和可靠性作者整合了分期乙漓、復(fù)發(fā)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分來建立列線圖模型。表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)生存率的預(yù)測(cè)影響最大(圖3c )释移。預(yù)測(cè)LUAD 1年叭披、3年和5年OS的諾姆圖校準(zhǔn)圖顯示實(shí)際觀察和諾姆圖預(yù)測(cè)之間具有極好的一致性(圖3d )，諾姆圖模型的C指數(shù)為0.742 ( 95 % CI = 0.701 ~ 0.784 , P = 2.93e-30)玩讳。此外涩蜘，諾姆圖預(yù)測(cè)1、3和5年OS的AUC值大于分期熏纯、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和復(fù)發(fā)同诫，表明坐著的列線圖是預(yù)測(cè)LUAD患者臨床結(jié)局的重要因素(圖3e - g )。

圖 3 指示變量與LUAD患者預(yù)后的相關(guān)性

風(fēng)險(xiǎn)模型與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的關(guān)聯(lián)

為了研究免疫細(xì)胞特征與lrRIGs風(fēng)險(xiǎn)模型之間的關(guān)系樟澜，首先基于ESTIMATE算法計(jì)算來自TCGA_LUAD數(shù)據(jù)庫的每個(gè)LUAD樣本的ESTIMATE評(píng)分和免疫評(píng)分误窖。結(jié)果顯示，ESTIMATE評(píng)分（1927.23 vs. 1404.48秩贰，P < 0.05）和免疫評(píng)分（1642.43 vs. 1323.45霹俺，P <0.05），低危組較高危組顯著增高（圖4a毒费、B）丙唧。接下來，作者使用通過估計(jì)RNA轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)子集的細(xì)胞類型鑒定（CIBERS0RT）方法分析了每個(gè)LUAD樣品中22個(gè)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相對(duì)比例觅玻。作者觀察到高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的顯著差異想际。特別地培漏，高風(fēng)險(xiǎn)組的特征在于相對(duì)高比例的T細(xì)胞CD 4記憶激活、NK細(xì)胞靜息和巨噬細(xì)胞MO胡本，而低風(fēng)險(xiǎn)組顯示相對(duì)高比例的漿細(xì)胞牌柄、T4細(xì)胞CD 4記憶靜息和肥大細(xì)胞靜息（圖4c; P < 0.05）。隨后作者使用微環(huán)境細(xì)胞群體計(jì)數(shù)（MCP-計(jì)數(shù)器）算法進(jìn)一步評(píng)估了八種免疫相關(guān)細(xì)胞和兩種基質(zhì)細(xì)胞的豐度侧甫。與高風(fēng)險(xiǎn)組相比友鼻，低風(fēng)險(xiǎn)組中內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞闺骚、髓樣樹突狀細(xì)胞、B系妆档、CD 8 T細(xì)胞和T細(xì)胞的豐度顯著增加（圖14d; P <0.05）僻爽。

圖 4 由9-基因標(biāo)簽定義的高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的免疫微環(huán)境的比較。

風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫療法的關(guān)聯(lián)

一些LUAD患者通過免疫治療贾惦，特別是免疫檢查點(diǎn)抑制劑獲得了巨大的臨床效益胸梆。然而，選擇對(duì)免疫療法有反應(yīng)的患者仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)须板。目前碰镜，免疫檢查點(diǎn)蛋白表達(dá)水平[27,28]、I類人類白細(xì)胞抗原(HLA)家族成員和TMB等生物標(biāo)志物已顯示出預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的潛力习瑰。因此绪颖，作者首先檢查了免疫檢查點(diǎn)在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間是否有差異表達(dá)。如圖5a所示甜奄，與高危組相比柠横，低風(fēng)險(xiǎn)組IDO1、CTLA-4课兄、LAG3牍氛、CD47、CD160烟阐、CD244搬俊、BTLA、TIGIT蜒茄、ICOS的表達(dá)水平顯著升高唉擂。相反，高危組CD276扩淀、ARHGEF5的表達(dá)水平較高楔敌。接下來，從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載562例LUAD患者的單核苷酸突變數(shù)據(jù)驻谆，并使用maftools包進(jìn)行處理卵凑。結(jié)果顯示高危組TMB顯著高于低危組(7.57 vs. 5.99, P = 4.9e-4)(圖5b)庆聘。

接下來，作者進(jìn)一步研究了I類人白細(xì)胞抗原（HLA）家族成員的表達(dá)勺卢，因?yàn)镠LA通過在細(xì)胞表面上呈遞細(xì)胞內(nèi)肽來負(fù)責(zé)新抗原呈遞和溶細(xì)胞T細(xì)胞活性伙判。缺乏HLA可能會(huì)損害細(xì)胞呈遞新抗原的能力并導(dǎo)致免疫耐受。結(jié)果表明黑忱，各種HLA家族成員的表達(dá)在兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之間顯著不同（圖5c; P < 0.05）宴抚。事實(shí)上，大多數(shù)HLA家族成員甫煞，包括HLA-J菇曲、HLA-E、HLA-DRB 6抚吠、HLA-DRB 5常潮、HLA-DRB 1、HLA-DRA楷力、HLADQB 1喊式、HLA-DQB 2、HLA-DQA 1萧朝、HLA-DQA 2岔留、HLA-DPB 1、HLA-DPB 2检柬、HLA-DPA 1献联、HLA-DOA、HLA-DOB厕吉、HLA-DMA和HLA-DMB酱固，相對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)組中的表達(dá)，在高風(fēng)險(xiǎn)組中顯示降低的表達(dá)头朱。另外运悲，癌癥免疫組圖譜（TCIA）是基于TCGA提供全面免疫基因組學(xué)分析的數(shù)據(jù)庫。在此项钮，作者使用TCIA數(shù)據(jù)庫通過免疫表型評(píng)分（IPS）評(píng)估具有不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的LUAD患者的免疫治療應(yīng)答班眯。結(jié)果顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組中的總IPS和CTLA-4阻斷劑的IPS顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組中的IPS（圖5d烁巫，e）署隘，其強(qiáng)烈預(yù)測(cè)具有較低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的LUAD患者將具有更好的免疫療法應(yīng)答，尤其是對(duì)于CTLA-4阻斷劑亚隙。相比之下磁餐，PDl pus CTLA-4阻斷劑和PDl阻斷劑的IPS在風(fēng)險(xiǎn)組之間沒有顯著差異（圖5f，g）。

最后诊霹，作者嘗試通過沉默與風(fēng)險(xiǎn)模型中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分正相關(guān)的關(guān)鍵基因來驗(yàn)證生物信息學(xué)分析的上述結(jié)果羞延。鑒于GPI具有圖。S1I和S4E）脾还。用shRNA沉默了CMT167細(xì)胞中的mGPI基因伴箩，并獲得了穩(wěn)定的細(xì)胞系。接下來研究GPI沉默是否可以影響由免疫檢查點(diǎn)阻斷產(chǎn)生的抗腫瘤作用鄙漏。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CMT167腫瘤可對(duì)抗CTLA-4抗體單一療法產(chǎn)生應(yīng)答嗤谚。有趣的是，在CMT167細(xì)胞中由sh3mGPI介導(dǎo)的mGPI敲低使得細(xì)胞系在CMT167/sh3mGPI皮下腫瘤模型中對(duì)抗CTLA-4抗體[腫瘤抑制率（%）= 93.3%]比對(duì)照CMT167/shNC細(xì)胞[腫瘤抑制率（%）= 80.7%]更敏感（n= 5/組）怔蚌。與抗CTLA-4治療相比巩步，mGPI敲減與抗CTLA-4治療的組合顯著降低腫瘤重量并抑制腫瘤生長(zhǎng)中。在實(shí)驗(yàn)期間未觀察到可辨別的不良事件桦踊。這些數(shù)據(jù)表明渗钉，風(fēng)險(xiǎn)基因的表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)阻斷的功效相關(guān)。

圖 5 免疫檢查點(diǎn)钞钙、HLA和錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)和TMB的分析。

LUAD危險(xiǎn)模型與化療反應(yīng)的關(guān)系

鑒于化療是臨床中腫瘤治療的關(guān)鍵手段之一声离，作者通過使用R包pRRophetic計(jì)算IC50來探索風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與對(duì)化療藥物的臨床反應(yīng)之間的關(guān)系芒炼。基于癌癥基因組計(jì)劃（CGP）數(shù)據(jù)庫术徊，篩選了7種化療藥物（順鉑本刽、多西他賽、多柔比星赠涮、吉西他濱子寓、依托泊苷、紫杉醇和阿糖胞苷）和2種靶向藥物（阿昔替尼和吉非替尼）笋除，這些藥物均已用于肺腺癌的臨床治療斜友。作者觀察到高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的藥物反應(yīng)不同。在肺癌化療藥物中垃它，多柔比星鲜屏、紫杉醇、吉西他濱国拇、依托泊苷和多西他賽在高危組具有較高的藥物反應(yīng)洛史。對(duì)于肺癌的靶向藥物，阿西替尼在低危組中具有良好的反應(yīng)（圖 6）酱吝。根據(jù)多變量Cox分析也殖，預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)基因中TNFRSF11A和GPI具有高風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，表明其表達(dá)顯著影響LUAD患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分务热。因此忆嗜，作者選擇使用shRNA沉默H1299和A549細(xì)胞中的TNFRSF11A或GPI基因己儒，以探索這些基因的表達(dá)是否影響腫瘤細(xì)胞對(duì)常用化療藥物的敏感性，如多柔比星（sc-280681 A霎褐，SANTA）和多西他賽（HY-B 0011址愿，MCE）。用各種濃度的多柔比星（0.1冻璃、1响谓、2.5、5省艳、10和20 μ Μ）或多西他賽（0.1娘纷、1、10跋炕、20赖晶、50和100 μΜ）處理腫瘤細(xì)胞24小時(shí)，并在GraphPad Prism 6程序中計(jì)算抑制濃度50（IC50）值辐烂。體外實(shí)驗(yàn)表明遏插，與對(duì)照A549/shNC（IC 50分別為1.531 μM，4.605 μM）和H1299/shNC（IC 50分別為2.252 μM纠修，8.042 μM）相比胳嘲，sh1GPI在A549和H1299細(xì)胞中敲低GPI使兩種細(xì)胞系對(duì)多柔比星（IC 50分別為4.548 μM，8.549 μM）和多西他賽（IC 50分別為24.85 μM扣草，30.81μM）的敏感性降低了牛。

圖 6 在TCGA數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)不同風(fēng)險(xiǎn)人群中患者對(duì)靶向治療和標(biāo)準(zhǔn)化療的反應(yīng)。

預(yù)后標(biāo)志基因GPI影響LUAD患者的預(yù)后辰妙，其機(jī)制與mTORC1信號(hào)通路的激活有關(guān)

為了更深入地了解LUAD預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)基因的潛在機(jī)制鹰祸，基于TCGA _ LUAD、GSE31210密浑、GES68465和GSE13213數(shù)據(jù)庫蛙婴，通過比較這些標(biāo)志性基因的高表達(dá)和低表達(dá)來進(jìn)行GSEA。GPI是9個(gè)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)基因之一尔破；它對(duì)LUAD的OS和RFS的影響最為顯著敬锐。先前的研究報(bào)道，GPI與TCGA _ LUAD呆瞻、GSE31210台夺、GES68465和GSE13213數(shù)據(jù)庫的不良結(jié)果相關(guān)。GPI是9個(gè)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)基因之一痴脾；它對(duì)LUAD的OS和RFS的影響最為顯著颤介；GPI與LUAD、結(jié)直腸癌、腎癌滚朵、乳腺癌冤灾、子宮內(nèi)膜癌的不良轉(zhuǎn)移有關(guān)。然而辕近，GPI對(duì)LUAD惡性生物學(xué)行為及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響尚不清楚韵吨。因此，我們選擇GPI作為進(jìn)一步研究的對(duì)象移宅。結(jié)果表明归粉，在TCGA_LUAD、GSE31210漏峰、GES68465和GSE13213數(shù)據(jù)庫中糠悼，幾個(gè)參與mTORC1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)控基因在GPI高表達(dá)的細(xì)胞中持續(xù)富集。提示在LUAD患者中GPI表達(dá)與mTORC1信號(hào)通路呈正相關(guān)(圖7a-d)浅乔。

隨后倔喂，作者進(jìn)行Western blot分析，檢測(cè)GPI在A549靖苇、H1299席噩、H1373、H1573和BEAS- 2B細(xì)胞系中的表達(dá)水平贤壁。與正常肺組織和BEAS-2B細(xì)胞系相比班挖，GPI在A549和H1299細(xì)胞中明顯過表達(dá)(圖7e)。通過慢病毒轉(zhuǎn)染靶向GPI的shRNA在A549和H1299細(xì)胞中進(jìn)行內(nèi)源性GPI沉默芯砸。通過菌落形成實(shí)驗(yàn)(圖7f, g)和創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)(圖7h, i)，作者觀察到给梅，與對(duì)照組相比假丧，GPI基因下調(diào)顯著抑制了兩種細(xì)胞系的增殖和遷移。此外动羽，體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示包帚，與模擬對(duì)照組相比，A549/sh1GPI小鼠出現(xiàn)的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)更少(圖7j)运吓。此外渴邦，Western blot分析顯示，GPI的下調(diào)導(dǎo)致了p-mTOR拘哨、p-P70S6K和p-S6的降低谋梭，它們是mTORC1信號(hào)通路的關(guān)鍵下游分子(圖7k)。既往研究報(bào)道該通路的激活與多種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)倦青。因此瓮床，作者進(jìn)一步檢測(cè)了與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。我們觀察到，在A549和H1299細(xì)胞中隘庄，GPI沉默顯著降低了N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)踢步，增加了E-cadherin和γ-catenin的水平(圖7k)。這些結(jié)果提示GPI對(duì)肺腺癌細(xì)胞多種生物學(xué)特性的調(diào)控可能與mTORC1信號(hào)通路的激活有關(guān)丑掺。

圖 7 探討預(yù)后標(biāo)志基因GPI影響LUAD患者預(yù)后的可能機(jī)制获印。

結(jié)論

本研究通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)GPI的高表達(dá)與mTORC 1通路的激活密切相關(guān)。在A549和H1299細(xì)胞中街州，GPI敲低導(dǎo)致mTOR兼丰、P70 S6 K和S6的磷酸化減少，E-鈣粘蛋白的表達(dá)增加菇肃，N-鈣粘蛋白的表達(dá)減少地粪。我們推測(cè)mTORC 1信號(hào)通路的激活可能是GPI過表達(dá)腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵過程。當(dāng)然琐谤，這項(xiàng)研究有一些局限性蟆技。我們的研究主要基于公共數(shù)據(jù)庫和有限的LUAD臨床組織標(biāo)本。需要使用大規(guī)模斗忌、前瞻性和多中心臨床試驗(yàn)進(jìn)行額外的研究质礼，以驗(yàn)證這種九基因簽名的穩(wěn)健性和可重復(fù)性。