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【寫在前面的話】：首先掠兄，這一篇博文中的內(nèi)容并非原創(chuàng)，而是對多篇文獻(xiàn)中內(nèi)容的直接摘錄芽唇，有些圖片和資料還來自身邊的同事（在此深表謝意Ｋ俄铩）内斯，再夾雜自己的零星想法，寫在這里分享與大家净薛，同時也是為了方便自己日后若有需要能夠方便獲得汪榔，文章比較長。
摘要：從1977年第一代DNA測序技術(shù)（Sanger法）1肃拜，發(fā)展至今三十多年時間痴腌，測序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展，從第一代到第三代乃至第四代燃领，測序讀長從長到短士聪，再從短到長。雖然就當(dāng)前形勢看來第二代短讀長測序技術(shù)在全球測序市場上仍然占有著絕對的優(yōu)勢位置猛蔽，但第三和第四代測序技術(shù)也已在這一兩年的時間中快速發(fā)展著剥悟。測序技術(shù)的每一次變革，也都對基因組研究曼库，疾病醫(yī)療研究区岗，藥物研發(fā)，育種等領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推動作用毁枯。在這里我主要對當(dāng)前的測序技術(shù)以及它們的測序原理做一個簡單的小結(jié)慈缔。
生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學(xué)的研究有著十分重要的意義。以上（圖1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來种玛，整個測序技術(shù)的發(fā)展歷程胀糜。
第一代測序技術(shù)
第一代DNA測序技術(shù)用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創(chuàng)的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學(xué)法（鏈降解）. 并在1977年，桑格測定了第一個基因組序列蒂誉，是噬菌體X174的教藻，全長5375個堿基1。自此右锨，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力括堤，并以此為開端步入基因組學(xué)時代。研究人員在Sanger法的多年實踐之中不斷對其進(jìn)行改進(jìn)。在2001年悄窃，完成的首個人類基因組圖譜就是以改進(jìn)了的Sanger法為其測序基礎(chǔ)讥电，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵轧抗，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)恩敌，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列（圖2）横媚。這個網(wǎng)址為sanger測序法制作了一個小短片纠炮，形象而生動。
值得注意的是灯蝴，就在測序技術(shù)起步發(fā)展的這一時期中恢口，除了Sanger法之外還出現(xiàn)了一些其他的測序技術(shù)，如焦磷酸測序法穷躁、鏈接酶法等耕肩。其中，焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術(shù)所使用的測序方法2–4问潭，而連接酶測序法是后來ABI公司SOLID技術(shù)使用的測序方法2,4猿诸，但他們的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中斷DNA合成反應(yīng)的dNTP。
第二代測序技術(shù)
總的說來狡忙，第一代測序技術(shù)的主要特點是測序讀長可達(dá)1000bp梳虽，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，但其測序成本高去枷，通量低等方面的缺點怖辆，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用是复。因而第一代測序技術(shù)并不是最理想的測序方法删顶。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)淑廊、illumina公司的Solexa逗余，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技術(shù)誕生了。第二代測序技術(shù)大大降低了測序成本的同時季惩，還大幅提高了測序速度录粱，并且保持了高準(zhǔn)確性，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間画拾，而使用二代測序技術(shù)則僅僅需要1周啥繁，但在序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)則要短很多。表1和圖3對第一代和第二代測序技術(shù)各自的特點以及測序成本作了一個簡單的比較5青抛，以下我將對這三種主要的第二代測序技術(shù)的主要原理和特點作一個簡單的介紹旗闽。
1.?Illumine?
Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測序機器，這兩個系列的技術(shù)核心原理是相同的2,4。這兩個系列的機器采用的都是邊合成邊測序的方法适室，它的測序過程主要分為以下4步嫡意，如圖4.
???? （1）DNA待測文庫構(gòu)建
利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外捣辆，主要是打斷成200-500bp長的序列片段蔬螟，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫汽畴。
???? （2）Flowcell
Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道旧巾，當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時候會隨機附著在flowcell表面的channel上整袁。每個Flowcell有8個channel菠齿，每個channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因）坐昙，并能支持DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴增绳匀。
???? （3）橋式PCR擴增與變性
橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴增炸客，如圖4.a所示疾棵。經(jīng)過不斷的擴增和變性循環(huán)，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束痹仙，每一個束都含有單個DNA模板的很多分拷貝是尔，進(jìn)行這一過程的目的在于實現(xiàn)將堿基的信號強度放大，以達(dá)到測序所需的信號要求开仰。?
（4）測序
測序方法采用邊合成邊測序的方法拟枚。向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測序法）众弓。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護(hù)恩溅，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后谓娃，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉脚乡。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液滨达，用激光激發(fā)熒光信號奶稠，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基捡遍。這樣熒光信號記錄完成后锌订，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP?3’-OH保護(hù)基團，以便能進(jìn)行下一輪的測序反應(yīng)画株。Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題辆飘，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換涩搓，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序為例劈猪，30x測序深度大約為1周昧甘。
2. Roche 454?
Roche 454測序系統(tǒng)是第一個商業(yè)化運營二代測序技術(shù)的平臺。它的主要測序原理是（圖5 abc）2：
（1）DNA文庫制備
454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同战得，它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段充边，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴增常侦，連接載體浇冰，構(gòu)建單鏈DNA文庫（圖5a）。
（2）Emulsion PCR （乳液PCR聋亡，其實是一個注水到油的獨特過程）
454當(dāng)然DNA擴增過程也和illumina的截然不同肘习，它將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育坡倔、退火漂佩。
乳液PCR最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”（水包油）罪塔，基本過程是在PCR反應(yīng)前投蝉，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴征堪。這些小水滴就構(gòu)成了獨立的PCR反應(yīng)空間瘩缆。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個磁珠佃蚜。
這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補的DNA序列庸娱，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結(jié)合在磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑谐算，所以保證了每個與磁珠結(jié)合的小片段都能獨立進(jìn)行PCR擴增熟尉，并且擴增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反應(yīng)完成后氯夷，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來臣樱。進(jìn)過擴增靶擦，每個小片段都將被擴增約100萬倍腮考，從而達(dá)到下一步測序所要求的DNA量。
（3）焦磷酸測序
測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠玄捕，接著將磁珠放在一種PTP平板上踩蔚。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠枚粘，通過這種方法來固定每個磁珠的位置馅闽，以便檢測接下來的測序反應(yīng)過程。
測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中福也，啟動測序反應(yīng)局骤。測序反應(yīng)以磁珠上大量擴增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)暴凑。如果dNTP能與待測序列配對峦甩，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP现喳。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光凯傲，同時由PTP板另一側(cè)的CCD照相機記錄，最后通過計算機進(jìn)行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果嗦篱。由于每一種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同冰单，因此可以根據(jù)熒光的顏色來判斷被測分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后灸促，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP诫欠，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測序反應(yīng)進(jìn)入下一個循環(huán)浴栽。由于454測序技術(shù)中呕诉，每個測序反應(yīng)都在PTP板上獨立的小孔中進(jìn)行，因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差吃度。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于其能獲得較長的測序讀長甩挫，當(dāng)前454技術(shù)的平均讀長可達(dá)400bp，并且454技術(shù)和illumina的Solexa和Hiseq技術(shù)不同椿每，它最主要的一個缺點是無法準(zhǔn)確測量同聚物的長度伊者，如當(dāng)序列中存在類似于PolyA的情況時，測序反應(yīng)會一次加入多個T间护，而所加入的T的個數(shù)只能通過熒光強度推測獲得亦渗，這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因汁尺，454技術(shù)會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤法精。?
3. Solid技術(shù)?
Solid測序技術(shù)是ABI公司于2007年開始投入用于商業(yè)測序應(yīng)用的儀器。它基于連接酶法痴突，即利用DNA連接酶在連接過程之中測序（圖6）2,4搂蜓。它的原理是：
（1）DNA文庫構(gòu)建
? ? ? ? ? ? ? 片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體辽装，構(gòu)建單鏈DNA文庫帮碰。
? ? ? ? ? ?（2）Emulsion PCR
Solid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsion PCR拾积，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多殉挽，只有1um丰涉。在擴增的同時對擴增產(chǎn)物的3’端進(jìn)行修飾，這是為下一步的測序過程作的準(zhǔn)備斯碌。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上一死。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個傻唾、4個或8個測序區(qū)域（圖6-a）摘符。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量策吠。
? ? ? ? ? ?（3）連接酶測序
這一步是Solid測序的獨特之處逛裤。它并沒有采用以前測序時所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶猴抹。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物带族，這里將其簡單表示為：3’-XXnnnzzz-5’。連接反應(yīng)中蟀给，這些探針按照堿基互補規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對蝙砌。探針的5’末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red跋理、CY3择克、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個8堿基單鏈熒光探針中前普，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的肚邢，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨特測序法拭卿，兩個堿基確定一個熒光信號骡湖，相當(dāng)于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法峻厚。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時响蕴，就會發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號惠桃，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1浦夷，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號后辜王，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割劈狐，這樣就能移除熒光信號，以便進(jìn)行下一個位置的測序誓禁。不過值得注意的是懈息，通過這種測序方法肾档，每次測序的位置都相差5位摹恰。即第一次是第1辫继、2位，第二次是第6俗慈、7位……在測到末尾后姑宽，要將新合成的鏈變性，洗脫闺阱。接著用引物n-1進(jìn)行第二輪測序炮车。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個堿基（圖6-a.?8）酣溃。也即是瘦穆，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測序位置往3’端移動一個堿基位置，因而就能測定第0赊豌、1位和第5扛或、6位……第二輪測序完成，依此類推碘饼，直至第五輪測序熙兔，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了兩次艾恼。該技術(shù)的讀長在2×50bp住涉，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次檢測钠绍，這一技術(shù)的原始測序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%舆声，而15x覆蓋率時的準(zhǔn)確性更是達(dá)到了99.999%，應(yīng)該說是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了柳爽。但在熒光解碼階段纳寂，鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號，因而一旦發(fā)生錯誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯誤泻拦。
第三代測序技術(shù)
測序技術(shù)在近兩三年中又有新的里程碑毙芜。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術(shù)，被稱之為第三代測序技術(shù)争拐。與前兩代相比腋粥，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進(jìn)行PCR擴增架曹。
其中PacBio SMRT技術(shù)其實也應(yīng)用了邊合成邊測序的思想5隘冲，并以SMRT芯片為測序載體“笮郏基本原理是： DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型展辞。同時這個 DNA 聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術(shù)的一個關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區(qū)別出來万牺。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔罗珍。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來洽腺，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會輻射到周圍覆旱，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理）,從而可起保護(hù)作用蘸朋。同理,在一個反應(yīng)管(SMRTCell:單分子實時反應(yīng)孔)中有許多這樣的圓形納米小孔,?即 ZMW(零模波導(dǎo)孔),外徑 100多納米,比檢測激光波長小(數(shù)百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū),能量被限制在一個小范圍(體積20X 10-21 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個小反應(yīng)區(qū)域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實現(xiàn)將背景降到最低。另外扣唱，可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間藕坯，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾噪沙，則通過聚合酶時的速度會減慢炼彪，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來之間檢測甲基化等信息（圖7）正歼。SMRT技術(shù)的測序速度很快霹购，每秒約10個dNTP。但是朋腋，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通财敫怼），達(dá)到15%,但好在它的出錯是隨機的旭咽，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯誤的偏向贞奋，因而可以通過多次測序來進(jìn)行有效的糾錯。
Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同穷绵，它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)5轿塔。該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，他們設(shè)計了一種特殊的納米孔仲墨，孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭勾缭。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時，它們使電荷發(fā)生變化目养，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的）俩由，靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基（圖8）。
該公司在去年基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(AGBT)上推出第一款商業(yè)化的納米孔測序儀癌蚁，引起了科學(xué)界的極大關(guān)注幻梯。納米孔測序（和其他第三代測序技術(shù)）有望解決目前測序平臺的不足，納米孔測序的主要特點是：讀長很長努释，大約在幾十kb碘梢，甚至100 kb;錯誤率目前介于1%至4%，且是隨機錯誤伐蒂，而不是聚集在讀取的兩端;數(shù)據(jù)可實時讀取;通量很高(30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成);起始DNA在測序過程中不被破壞;以及樣品制備簡單又便宜煞躬。理論上，它也能直接測序RNA。
納米孔單分子測序計算還有另一大特點恩沛，它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶在扰，而不必像傳統(tǒng)方法那樣對基因組進(jìn)行bisulfite處理。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)現(xiàn)象有極大的幫助复唤。并且改方法的測序準(zhǔn)確性可達(dá)99.8%健田，而且一旦發(fā)現(xiàn)測序錯誤也能較容易地進(jìn)行糾正烛卧。但目前似乎還沒有應(yīng)用該技術(shù)的相關(guān)報道佛纫。
其他測序技術(shù)
目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測序技術(shù)——Ion Torrent6。該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片总放， 一個小孔就是一個測序反應(yīng)池呈宇。當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時，會釋放出一個氫離子局雄，反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變甥啄，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號，H+離子信號再直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號炬搭，從而讀出DNA序列（圖9）蜈漓。這一技術(shù)的發(fā)明人同時也是454測序技術(shù)的發(fā)明人之一——Jonathan Rothberg，它的文庫和樣本制備跟454技術(shù)很像宫盔，甚至可以說就是454的翻版融虽，只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測H+信號的變化來獲得序列堿基信息灼芭。Ion?Torrent相比于其他測序技術(shù)來說有额，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此彼绷，成本相對來說會低巍佑，體積也會比較小，同時操作也要更為簡單寄悯，速度也相當(dāng)快速萤衰，除了2天文庫制作時間，整個上機測序可在2-3.5小時內(nèi)完成猜旬，不過整個芯片的通量并不高腻菇，目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗證的測序昔馋。
小結(jié)
以上筹吐，對各代測序技術(shù)的原理做了簡要的闡述，這三代測序技術(shù)的特點比較匯總在以下表1和表2中秘遏。其中測序成本丘薛，讀長和通量是評估該測序技術(shù)先進(jìn)與否的三個重要指標(biāo)。第一代和第二代測序技術(shù)除了通量和成本上的差異之外邦危，其測序核心原理（除Solid是邊連接邊測序之外）都是基于邊合成邊測序的思想洋侨。第二代測序技術(shù)的優(yōu)點是成本較之一代大大下降舍扰，通量大大提升，但缺點是所引入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯誤率希坚，并且具有系統(tǒng)偏向性边苹，同時讀長也比較短。第三代測序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點而開發(fā)的裁僧，它的根本特點是單分子測序个束，不需要任何PCR的過程，這是為了能有效避免因PCR偏向性而導(dǎo)致的系統(tǒng)錯誤聊疲，同時提高讀長茬底，并要保持二代技術(shù)的高通量，低成本的優(yōu)點获洲。
表1：測序技術(shù)的比較
表2：主流測序機器的成本測序比較
以下圖10展示了當(dāng)前全球測序儀的分布情況阱表。圖中的幾個熱點區(qū)主要分布在中國的深圳（主要是華大），南歐贡珊，西歐和美國最爬。
參考文獻(xiàn)
1.??? Sanger, F. & Nicklen, S. DNA sequencing with chain-terminating.?74, 5463–5467 (1977).
2.??? Mardis, E. R. Next-generation DNA sequencing methods.?Annual review of genomics and human genetics9, 387–402 (2008).
3.??? Shendure, J. & Ji, H. Next-generation DNA sequencing.?Nature biotechnology26, 1135–45 (2008).
4.??? Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation.?Nature reviews. Genetics11, 31–46 (2010).
5.??? Niedringhaus, T. P., Milanova, D., Kerby, M. B., Snyder, M. P. & Barron, A. E. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies. 4327–4341 (2011).
6.??? Rothberg, J. M.?et al.?An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing.Nature?475, 348–52 (2011).
