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編者按：

microRNA是一種長度為22~25nt的內(nèi)源性非編碼RNA，其在蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用郊供。是近20年來科學(xué)界研究熱點踪古。根據(jù)其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用，miRNA大致可分為促癌性miRNA與抑癌性miRNA诀豁。

膽囊，是一個位于右肋下肝臟后方的梨形囊袋狀器官窥妇，頸部連膽囊管舷胜，膽囊管向上連接肝總管，向下連接膽總管（解剖結(jié)構(gòu)見下圖）活翩；膽囊具有儲存和濃縮膽汁的功能烹骨，常見的膽囊相關(guān)疾病包括膽結(jié)石、膽囊炎材泄、膽囊息肉及膽囊癌等沮焕。膽囊癌（GBC）是最常見的膽道惡性腫瘤，也是第七大最常見的胃腸道癌癥拉宗。流行病學(xué)調(diào)查顯示峦树，GBC的發(fā)生率為2.5/10^5人辣辫。盡管發(fā)病率相對較低，但與GBC相關(guān)的死亡率仍高于其他癌癥魁巩。且就診時患者往往處于晚期急灭，失去手術(shù)機(jī)會，晚期膽囊癌的預(yù)后很差歪赢，5年生存率僅為5％化戳。因此，尋找一種新的治療方法對中晚期膽囊癌來說是至關(guān)重要的埋凯，這其中就包括miRNA在膽囊癌中的基礎(chǔ)研究点楼。

膽囊的解剖位置（來源于維基百科）

今天給大家?guī)淼氖巧虾＝煌ù髮W(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院劉穎斌教授團(tuán)隊2017年在nature子刊Cell Death and Differentiation雜志上發(fā)表的MicroRNA-29c-5psuppresses gallbladder carcinoma progression by directly targeting CPEB4 andinhibiting the MAPK pathway 研究論文。

文章標(biāo)題

文章從運用miRNA芯片分析膽囊癌組織與癌旁組織（NAT）各miRNA表達(dá)差異開始白对，鑒定出miRNA-29c-5p在膽囊癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)掠廓，然后臨床分析了其與膽囊癌患者預(yù)后及臨床病例特征存在關(guān)聯(lián)，進(jìn)而在體內(nèi)外實驗中證明miR-29c-5p在膽囊癌細(xì)胞增殖中起重要作用甩恼，且通過減少上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制膽囊癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲蟀瞧，最后得出MicroRNA-29c-5p通過直接靶向CPEB4和抑制MAPK途徑來抑制膽囊癌的進(jìn)展的結(jié)論。

Results解讀：

圖1条摸、miRNA的表達(dá)在膽囊癌組織與癌旁組織存在差異及miR-29c-5p的表達(dá)與膽囊癌預(yù)后及臨床病理特征存在關(guān)聯(lián)

作者首先運用miRNA芯片分析比較GBC組織和NAT的miRNA表達(dá)譜悦污。結(jié)果顯示13種miRNA的水平發(fā)生了顯著變化（“> 2倍”），其中包括11個下調(diào)的miRNA和2個上調(diào)的miRNA（圖1a）钉蒲。與NAT相比切端，GBC組織中miR-29c的表達(dá)最顯著下調(diào)，表明miR-29c是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵介質(zhì)顷啼。作者通過qRT-PCR檢測40對GBC組織及其相應(yīng)的NAT的miR-29C-3P和-5p的表達(dá)水平踏枣。和miRNA芯片數(shù)據(jù)一致，與NAT相比钙蒙，腫瘤組織中的miR-29c-5p表達(dá)顯著下調(diào)（P = 0.018茵瀑；圖1b）。然而躬厌，miR-29c-3p的表達(dá)沒有顯著下降（P = 0.774;?圖1c）马昨，因此作者在隨后的研究中重點關(guān)注miR-29c-5p。與非轉(zhuǎn)移性GBC患者相比烤咧，發(fā)生轉(zhuǎn)移的GBC患者具有更低的miR-29c-5p表達(dá)水平（P <0.001偏陪；圖1d），可能暗示了miR-29c-5p參與GBC的轉(zhuǎn)移煮嫌。

因為miR-29c-5p表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，所以作者進(jìn)一步研究了miR-29c-5p表達(dá)對預(yù)測GBC轉(zhuǎn)移的診斷潛力抱虐。發(fā)現(xiàn)miR-29c-5p表達(dá)水平的ROC曲線（AUC）下面積為0.855（95％CI：0.733-0.977昌阿；圖1e）。miR-29c-5p表達(dá)水平的最佳臨界值（2-?ΔCT= 0.032）是基于ROC曲線分析選擇的;?因此，GBC組織中的miR-29c-5p表達(dá)水平被分為低表達(dá)組或高表達(dá)組懦冰。使用這些標(biāo)準(zhǔn)灶轰，分析了miR-29c-5p表達(dá)水平與GBC的臨床病理特征和預(yù)后之間的相關(guān)性。在具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GBC組織中刷钢，miR-29c-5p表達(dá)水平顯著降低（P <0.001笋颤；表1（未列））。

更有趣的是内地，生存分析表明伴澄，與miR-29c-5p低表達(dá)的患者相比，miR-29c-5p高表達(dá)的GBC患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）更好（1-和3年OS：55.7％和33.4％阱缓，而 32.0和16.0％非凌，P = 0.040；1年和3年DFS：85.1和60.8％荆针，而 35.9和12.0％敞嗡，P = 0.002；圖1f和g）

圖2航背、體內(nèi)體外實驗證明miR-29c-5p在膽囊癌細(xì)胞增殖中起重要作用

為了檢測miR-29c在GBC發(fā)生中的生物學(xué)功能喉悴，作者測定了miR-29c-3p和-5p在5種GBC細(xì)胞系和正常膽管上皮細(xì)胞系中的表達(dá)水平（圖2a）。與腫瘤組織特征一致玖媚，GBC細(xì)胞表達(dá)的miR-29c-5p水平低于miR-29c-3p箕肃。隨后作者將miR-29c前體（pre-miR-29c）及其特異性抑制劑anti-miR-29c-5p引入了GBC-SD和NOZ細(xì)胞系。通過實時PCR證實了miR-29c-5p的不同表達(dá)水平（圖2b）

進(jìn)一步作者采用CCK8與克隆形成實驗評估m(xù)iR-29c-5p在GBC細(xì)胞增殖中的作用最盅。結(jié)果表明突雪，與pre-miR-NC細(xì)胞相比，pre-miR-29c細(xì)胞的增殖明顯減少涡贱，而與抗NC相比咏删，anti-miR-29c-5p細(xì)胞的增殖明顯增加（圖2c和d），與該miRNA在GBC細(xì)胞增殖中的抑制作用一致问词。

隨后作者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-29c-5p后活化的Chk1和Chk2督函，即p-Chk1（S-345）和p-Chk2（T68），表達(dá)增加（圖2e和補(bǔ)充圖S2B）激挪。據(jù)此推測miR-29c-5p通過激活Chk1/2并隨后引起G1期阻滯促進(jìn)自發(fā)性DNA損傷修復(fù)辰狡，從而阻止了腫瘤的進(jìn)展。接著作者做了體內(nèi)實驗垄分，用miR-29c-5pagomir治療2周后宛篇，腫瘤生長明顯被抑制（圖2f）。此外薄湿，免疫組化顯示miR-29c-5pagomir接種的腫瘤組織中E-cadherin表達(dá)增加叫倍，波形蛋白表達(dá)降低偷卧，Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量減少以及缺乏磷酸化的MEK（圖2h）。

圖3吆倦、miR-29c-5p?在體外和體內(nèi)通過減少上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制GBC細(xì)胞遷移和侵襲

傷口愈合試驗表明听诸，GBC細(xì)胞中miR-29c-5p表達(dá)的增加與傷口閉合明顯減慢有關(guān)，而GBC細(xì)胞中miR-29c-5p表達(dá)的降低導(dǎo)致傷口閉合明顯增快（P <0.05蚕泽；圖3b）晌梨。Transwell實驗表明，pre-miR-29c細(xì)胞的侵襲性低于pre-miR-NC細(xì)胞须妻，而抗miR-29c-5p細(xì)胞的侵襲性高于抗NC細(xì)胞（P <0.001仔蝌；圖3a和補(bǔ)充圖S1C）。相應(yīng)的璧南，蛋白印跡實驗和免疫熒光（ICC）分析表明掌逛，miR-29c-5p的表達(dá)顯著增加了EMT相關(guān)基因E-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，并降低了波形蛋白的表達(dá)（圖3c和d及補(bǔ)充圖S1E–F）司倚。

為了在體內(nèi)證實這些發(fā)現(xiàn)豆混，作者通過尾靜脈注射進(jìn)行了肺腫瘤轉(zhuǎn)移測定，以監(jiān)測裸鼠中NOZ細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力动知。如圖3e所示皿伺，對照組的肺部轉(zhuǎn)移率和轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著要高于經(jīng)miR-29c-5p agomir治療的小鼠。這些結(jié)果在體內(nèi)外實驗表明了miR-29C-5P通過減少上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）抑制GBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲盒粮。

圖4鸵鸥、miR-29c-5p通過MAPK/ERK通路發(fā)揮細(xì)胞凋亡效應(yīng)

為了探究miR-29c-5p抑制GBC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，作者首先研究了miR-29c-5p對凋亡的影響丹皱。miR-29c-5p細(xì)胞和對照細(xì)胞的凋亡指數(shù)分別為38.76和25％（相對于GBC-SD細(xì)胞妒穴，P <0.001），分別為24.3和4％（對于NOZ細(xì)胞摊崭，P <0.001讼油；對于NOZ細(xì)胞，P <0.001）（圖4a）呢簸。此外矮台，抗miR-29c-5p細(xì)胞的凋亡指數(shù)低于陰性對照細(xì)胞（圖4a）。如圖4b根时，用pre-miR-29c處理的細(xì)胞顯示綠色熒光增加瘦赫，表明線粒體功能喪失。這些結(jié)果表明蛤迎，miR-29c-5p通過線粒體依賴性機(jī)制誘導(dǎo)凋亡确虱。

通過分析與miR-29c-5p相關(guān)的差異表達(dá)基因，作者推測MAPK / ERK信號通路是miR-29c-5p抑制GBC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的主要途徑（圖4c）替裆。隨后作者對參與MAPK信號通路的蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)進(jìn)行了蛋白印跡分析蝉娜。與對照組細(xì)胞相比唱较，miR-29c-5p過表達(dá)的細(xì)胞MEK1/2扎唾，p44/42 MAPK和Akt在Ser473處磷酸化水平降低召川，而總蛋白水平則不受miR-29c-5p表達(dá)的影響。滅活的Akt隨后調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白胸遇。結(jié)果荧呐，相對于對照細(xì)胞，在miR-29c-5p過表達(dá)的細(xì)胞中纸镊，caspase-9倍阐，caspase-3和PARP的后續(xù)切割均增加。當(dāng)miR-29c-5p在GBC細(xì)胞中被抑制時逗威，MEK1 / 2峰搪，ERK和Akt的磷酸化被逆轉(zhuǎn)（圖4d和補(bǔ)充圖S2A）。此外凯旭，當(dāng)使用MEK1 / 2抑制劑時概耻，miR-29C-5P阻斷MEK1 / 2和ERK的磷酸化的效果幾乎完全消失（圖4e和補(bǔ)充圖S2C）。這些結(jié)果表明罐呼，MAPK / ERK途徑可能參與了miR-29c-5p誘導(dǎo)的GBC細(xì)胞凋亡鞠柄。

圖5、CPEB4是miR-29c-5p的直接靶向基因嫉柴。

（a）由兩個計算預(yù)測程序預(yù)測的潛在miR-29c-5p目標(biāo)厌杜。列出的它們之間的重疊（右）。（b）如材料和方法中所述構(gòu)建熒光素酶報道質(zhì)粒计螺。顯示了CPEB4的3'UTR內(nèi)的預(yù)測的miR-29c-5p結(jié)合位點的序列夯尽，包括野生型和突變體結(jié)合位點。將上述報告質(zhì)恋锹或模擬報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到感染了pre-miR-29c的293 T細(xì)胞中后匙握，分析了相對熒光素酶活性（*** P <0.001）。Pre-miR-29c而非pre-miR-NC特異性地降低了CPEB4 -3'?-UTR-WT熒光素酶報道基因的表達(dá)谊娇。相反肺孤，在用CPEB4--3'?-UTR-Mut報道基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未觀察到相對熒光素酶表達(dá)的變化（c）用抗miR-29c-5p，抗NC济欢，pre-miR-NC或pre-miR-29c感染的GBC-SD和NOZ細(xì)胞中CPEB4蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析赠堵。總的來說，這些結(jié)果表明CPEB4是miR-29c-5p的直接靶標(biāo)法褥，并且可以被miR-29c-5p負(fù)調(diào)節(jié)茫叭。

我們的qRT-PCR分析顯示，與NAT相比半等，GBC組織中CPEB4的表達(dá)顯著上調(diào)（圖5d）揍愁，使用Pearson相關(guān)分析呐萨，我們計算了腫瘤樣品中miR-29c-5p與CPEB4 mRNA水平之間的顯著負(fù)相關(guān)（R = -0.571，P <0.001莽囤；圖5e和f）谬擦，使用線性回歸分析和配對t檢驗，對圖5d中使用的相同樣品朽缎，確定了miR-29c-5p和CPEB4表達(dá)水平之間的相關(guān)性惨远。（g）有代表性的IHC顯微照片，顯示在具有高或低miR-29c-5p表達(dá)的GBC組織中CPEB4蛋白的表達(dá)话肖。（i）使用Kaplan-Meier分析比較了高和低miR-29c-5p表達(dá)組與高和低CPEB4表達(dá)組之間40名GBC患者的OS率北秽。

圖6、使用CPEB4表達(dá)載體或siCPEB4進(jìn)行功能獲得和功能喪失研究最筒。

我們使用一種補(bǔ)充方法來檢查CPEB4功能的獲得和喪失贺氓。具體來說，我們用缺少3'UTR的CPEB4表達(dá)載體敲低了GBC-SD細(xì)胞中CPEB4的表達(dá)或恢復(fù)了NOZ細(xì)胞中CPEB4的表達(dá)床蜘。CPEB4表達(dá)的恢復(fù)增強(qiáng)了表達(dá)miR-29c-5p的NOZ細(xì)胞的增殖和集落形成（圖6a和b）辙培。同樣，流式細(xì)胞儀分析表明CPEB4表達(dá)的恢復(fù)恢復(fù)了因miR-29c-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞周期停滯（圖6c）悄泥。此外虏冻，CPEB4的恢復(fù)顯著減弱了miR-29c-5p介導(dǎo)的對GBC細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用（圖6d 和補(bǔ)充圖S5B）。通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步分析了MAPK / ERK信號通路中的候選蛋白質(zhì)弹囚。結(jié)果表明厨相，異位表達(dá)或敲低miR-29c-5p會影響p-MEK，p-ERK和p-AKT的水平鸥鹉，并且分別通過重新引入或抑制CPEB4來消除這些作用（圖6e）蛮穿。這些發(fā)現(xiàn)支持以下觀點：CPEB4代表GBC中miR-29c-5p的腫瘤抑制功能的潛在機(jī)制中的重要靶標(biāo)。

圖7毁渗、TGF-?β誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移需要miR-29c-5p表達(dá)降低践磅。

在多種腫瘤中，TGF-β是與炎癥和轉(zhuǎn)移相關(guān)的最有力的細(xì)胞因子之一灸异。然而在GBC中很少有功能性實驗報道m(xù)iRNA與TGF表達(dá)之間的相關(guān)性府适。作者研究了TGF-?β是否參與GBC的發(fā)病機(jī)制以及miR-29c-5p / CPEB4誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移。為此肺樟，用TGF-?β處理了GBC細(xì)胞（補(bǔ)充圖S5A和D）檐春。有趣的是，發(fā)現(xiàn)TGF-?β治療可顯著降低miR-29c-5p的表達(dá)并增加CPEB4的水平mRNA么伯，提示TGF-?β負(fù)調(diào)控GBC細(xì)胞中的miR-29c-5p / CPEB4軸（圖7a和b）疟暖。接下來，作者檢測了miR-29c-5p模擬物是否可以抑制TGF-?β誘導(dǎo)的GBC轉(zhuǎn)移和侵襲。如所預(yù)期的俐巴，通過與pre-miR-29c一起孵育來減弱TGF-?β誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移（圖7c和d以及補(bǔ)充圖S5C）骨望。這些結(jié)果通過針對幾種EMT相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證實（圖7e）。這些結(jié)果表明miR-29c-5p / CPEB4軸在TGF-?β誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用（圖7f）欣舵，并強(qiáng)烈支持以下結(jié)論：miR-29c-5p在介導(dǎo)炎癥和癌癥兩者之間的聯(lián)系中起重要作用擎鸠。

文獻(xiàn)總結(jié)：

研究結(jié)果表明，miR-29c-5p在GBC中顯著下調(diào)邻遏。體內(nèi)外實驗表明TGF-β通過MAPK / ERK途徑誘導(dǎo)的miR-29C-5P的表達(dá)降低在膽囊癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移中具有重要作用以及通過直接靶向CPEB4的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化糠亩。這些結(jié)果為TGF-?β介導(dǎo)的GBC轉(zhuǎn)移的分子發(fā)病機(jī)理提供了新的機(jī)制研究，并為GBC的治療提供了潛在的新治療靶標(biāo)准验。

原文地址：https://www.nature.com/articles/cdd2016146

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