一酬蹋、前言

近日，美國圣母大學(xué)藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)中心的Brian Blagg教授在Angew上首次報(bào)道了Hsp90α選擇性抑制劑的發(fā)現(xiàn)。Blagg研究小組成員的主要目標(biāo)是設(shè)計(jì)，合成和評估Hsp90蛋白折疊過程的新型抑制劑推穷，已在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)表多篇論文。

二世曾、Hsp90α介紹

分子伴侶具有協(xié)助新生肽（客戶蛋白）的構(gòu)象成熟缨恒、復(fù)活變性蛋白等功能，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)轮听。熱休克蛋白(Heat Shock Proteins , HSPs)是生物體在應(yīng)激狀態(tài)(病毒感染骗露、缺氧、DNA損傷血巍、高溫萧锉、癌細(xì)胞等)下誘導(dǎo)合成一組高度保守的蛋白，故又稱為應(yīng)激蛋白述寡，廣泛存在于真核及原核生物中柿隙。根據(jù)同源程度及分子量大小，熱休克蛋白可分為Hsp110鲫凶、Hsp90禀崖、Hsp70、Hsp60螟炫、小分子Hsp等幾個(gè)家族波附，它們具有廣泛的生物學(xué)功能，在細(xì)胞生長昼钻、發(fā)育掸屡、分化、基因轉(zhuǎn)錄然评、蛋白質(zhì)合成仅财、折疊、運(yùn)輸碗淌、分解盏求、細(xì)胞骨架功能等多方面發(fā)揮重要作用抖锥。Hsp90是研究最為廣泛的熱休克蛋白家族，在細(xì)胞內(nèi)含量豐富, 占細(xì)胞蛋白總量的1%～2%风喇。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中宁改，Hsp90具有存在于細(xì)胞質(zhì)中的Hsp90α（誘導(dǎo)型）和Hsp90β（組成型）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（Grp94）魂莫、線粒體中的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1 (Trap1)四種亞型还蹲，具有不同功能（圖1）。

圖1 四種Hsp90亞型的結(jié)構(gòu)和功能

Hsp90單體主要由三個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域組成：N端(N-terminal domain, NTD)結(jié)構(gòu)域耙考，能夠結(jié)合ATP或與輔助分子伴侶相互作用谜喊，緊連著富含電荷的可變長度連接區(qū)域；中間結(jié)構(gòu)域(Middle domain, MD)倦始，含有客戶蛋白和輔助分子伴侶結(jié)合位點(diǎn)斗遏；C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD)，其二聚化結(jié)構(gòu)域具有保守的五肽片段(MEEVD)鞋邑，能夠錨定包含三角四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域 (tetratricopeptide repeat domain, TPR) 的輔助分子伴侶（圖1）诵次。

NTD已成為Hsp90抑制劑的主要作用靶點(diǎn)，通過與Hsp90 NTD的 ATP結(jié)合位點(diǎn)競爭性結(jié)合枚碗，發(fā)揮Hsp90活性抑制作用逾一。

三，首個(gè)Hsp90α選擇性抑制劑的發(fā)現(xiàn)

Hsp90負(fù)責(zé)超過300個(gè)客戶蛋白的構(gòu)象成熟肮雨，其中許多客戶蛋白是致癌轉(zhuǎn)化遵堵，生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此怨规，Hsp90已經(jīng)成為癌癥治療靶點(diǎn)而備受關(guān)注陌宿，目前已有18種Hsp90抑制劑處于臨床研究階段，但泛Hsp90抑制劑不可避免地產(chǎn)生某些副作用和毒性波丰，阻礙了臨床研究進(jìn)程壳坪，因此Hsp90亞型選擇性抑制劑的開發(fā)已經(jīng)成為重要的研究方向。Hsp90α亞型選擇性化合物的開發(fā)為剖析各亞型對相關(guān)疾病的作用和Hsp90泛抑制劑的毒性提供了新的工具和方法掰烟。

研究表明弥虐，敲除Hsp90α基因引起致癌客戶蛋白的降解，表明Hsp90α選擇性抑制劑能夠用于Hsp90α依賴性的癌癥治療媚赖。Hsp90α也能分泌到細(xì)胞外促進(jìn)傷口愈合、細(xì)胞黏附和炎癥反應(yīng)珠插。高侵襲性腫瘤細(xì)胞能夠分泌大量Hsp90α惧磺，激活基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)進(jìn)而誘導(dǎo)MMP-3的表達(dá)，驅(qū)動(dòng)腫瘤侵襲捻撑，因此開發(fā)Hsp90α選擇性抑制劑具有其獨(dú)特意義磨隘。

圖2 Radicicol缤底，AT13387，化合物1番捂，PU-H71个唧，KUNB31的結(jié)構(gòu)

Hsp90α和Hsp90β亞型選擇性抑制劑的設(shè)計(jì)極具挑戰(zhàn)性，因?yàn)閮煞N亞型在N端ATP結(jié)合位點(diǎn)上的同源性大于95%设预，且在ATP的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)上僅有52位和91位兩個(gè)氨基酸存在差異徙歼。在先前的研究中，通過分析Hsp90α和Hsp90β的N端ATP結(jié)合位點(diǎn)與根赤殼菌素(Radicicol)的相互作用模式鳖枕，作者確定了Radicicol的間苯二酚部分與Hsp90α和Hsp90β分別具有獨(dú)特的相互作用魄梯，于是以間苯二酚衍生物類泛Hsp90抑制劑AT13387類似物1為先導(dǎo)化合物，首先宾符，對化合物1與Hsp90α和Hsp90β的N-端ATP結(jié)合位點(diǎn)相互作用的計(jì)算分析表明酿秸，化合物1與Hsp90α的Ser52和Ile91形成了三個(gè)水分子介導(dǎo)的氫鍵，而化合物1與Hsp90β中的Ala52和Leu91形成了三個(gè)水分子介導(dǎo)的氫鍵魏烫，因此在Hsp90α的Ser52和Ile91周圍形成較小的親水口袋辣苏，而在Hsp90β的Ala52和Leu91周圍形成較大的疏水口袋。作者利用兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的細(xì)微差異哄褒，設(shè)計(jì)并發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)Hsp90β選擇性抑制劑KUNB31稀蟋，但由于Hsp90α中的口袋更小，具有不利的空間位阻作用读处，因此沒能通過類似方式設(shè)計(jì)Hsp90α選擇性抑制劑糊治。因此，Ser52/Ala52的差異是唯一能夠用于開發(fā)Hsp90α和β選擇性抑制劑的突破點(diǎn)(圖3C)罚舱。由于化合物1對Hsp90α和Hsp90β具有類似的親和性井辜，因此同樣以化合物1為先導(dǎo)化合物進(jìn)行Hsp90α選擇性抑制劑的設(shè)計(jì)。

圖3 化合物1與Hsp90α(A)和Hsp90β(B)的N端ATP結(jié)合位點(diǎn)相互作用及Hsp90α和Hsp90β的N-端ATP結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)化合物1的間苯二酚部分通過苯環(huán)2位的酚羥基與Asp93發(fā)生氫鍵相互作用管闷，4位酚羥基通過水分子A和B與Ser52形成氫鍵(圖3A,B)粥脚。因此，作者系統(tǒng)性地移除酚羥基以確定每個(gè)酚羥基對亞型結(jié)合的貢獻(xiàn)包个，于是設(shè)計(jì)了化合物2和化合物3(圖4)刷允，并進(jìn)行亞型選擇性評估。

圖4 化合物2和化合物3的結(jié)構(gòu)及其與Hspα的結(jié)合模式

結(jié)果表明碧囊，化合物3對Hsp90α的親和力是Hsp90β的大約10倍树灶，而化合物2對Hsp90β的親和力約為Hsp90α的2倍，因此4位酚羥基對Hsp90α的結(jié)合更有利糯而。

圖5 基于化合物1的構(gòu)效關(guān)系研究

基于以上結(jié)果天通，接下來，作者通過替換5位的異丙基以調(diào)節(jié)苯酚部分的空間環(huán)境和電子分布熄驼，并希望打開Hsp90的誘導(dǎo)型結(jié)合口袋 (圖6A)像寒。當(dāng)以Cl取代5-異丙基時(shí)導(dǎo)致親和力降低了大約10倍（4）烘豹，而替換成碘則完全失去親和力（5）。在5位引入Br時(shí)诺祸，選擇性最高(大于30倍)且IC50值約為2.73 μM（6）携悯，引入-CF3時(shí)，可能由于氟和酚羥基的H形成分子內(nèi)氫鍵導(dǎo)致化合物7的親和力降低筷笨。當(dāng)取代叔丁基時(shí)親和力與5相當(dāng)憔鬼，證明了球狀取代基能夠誘導(dǎo)Hsp90α選擇性的假設(shè)。

研究表明奥秆，Hsp90α的ATP結(jié)合位點(diǎn)上的位點(diǎn)1是一個(gè)誘導(dǎo)型口袋逊彭，當(dāng)沒有結(jié)合配體或結(jié)合不合適配體時(shí)處于“Close”狀態(tài)(如配體化合物1)，當(dāng)結(jié)合合適配體時(shí)(如嘌呤類配體PU-H71构订，格爾德霉素)侮叮，則誘導(dǎo)相關(guān)的氨基酸發(fā)生重排，形成新的結(jié)合通道悼瘾，口袋處于“Open”狀態(tài)囊榜，其內(nèi)部具有較多疏水殘基，是一個(gè)疏水性口袋亥宿，該口袋對配體的亞型選擇性也可能具有重要作用(圖6)卸勺。于是作者設(shè)計(jì)化合物10、11和12以探索化合物與位點(diǎn)1的相互作用 (圖7)烫扼，同時(shí)這些化合物也縮短了4-苯酚部分與Ser52之間的距離以增加對Hsp90α的結(jié)合親和力及選擇性(圖5）曙求。

圖6 PU-H71(A), AT13387 (B), 化合物12 (C)與Hsp90α的ATP結(jié)合口袋相互作用

結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物12與Hsp90α的結(jié)合親和力IC50約為4.8 μM，是Hsp90β的20倍以上映企。如圖6所示悟狱，PU-H71的亞甲二氧環(huán)誘導(dǎo)了位點(diǎn)1的打開(圖6A)。與能夠誘導(dǎo)位點(diǎn)1打開的泛Hsp90抑制劑PU-H71不同堰氓，化合物1能與位點(diǎn)1的關(guān)閉構(gòu)象結(jié)合(圖6B)挤渐。化合物12中5位的苯硫醚部分能夠靠近位點(diǎn)1，與PU-H71中到達(dá)開放構(gòu)象位點(diǎn)1的亞甲二氧基部分重疊(圖6C)双絮。盡管在Hsp90α和β中都存在相同的位點(diǎn)1浴麻，但作者認(rèn)為苯硫酚上的取代基能夠誘導(dǎo)Hsp90α的不同構(gòu)象，干擾4-苯酚與Ser52的相互作用囤攀。于是設(shè)計(jì)了系列取代苯硫醚類似物并進(jìn)行Hsp90α的親和力測試软免，其中化合物12a和12b分別含有亞甲二氧環(huán)和亞乙基二氧環(huán)，作者猜測可能與Tyr139形成額外的氫鍵相互作用(圖8a)焚挠。

圖7 基于化合物12的構(gòu)效關(guān)系研究

結(jié)果表明或杠，化合物12a和12b對Hsp90α的親和力確實(shí)提高。同樣，含有3,4-二甲氧基苯硫醚的化合物12c對Hsp90α的IC50約為530 nM向抢，選擇性約為Hsp90β的22倍。苯硫醚環(huán)上不同位置取代甲基的結(jié)果表明胚委，3位和4位取代能夠提高對Hsp90α的結(jié)合親和力挟鸠。因此，在苯硫醚環(huán)的3位和4位進(jìn)行取代設(shè)計(jì)了化合物12d亩冬、12e艘希、12f和12g。其中12d和12e對Hsp90α的IC50分別為840 nM和720 nM硅急，而三甲基取代的12f親和力降低覆享。3-甲氧基-5-甲基取代的12g對Hsp90α的親和力約為900 nM。3-甲基變?yōu)?-乙基時(shí)親和力增加营袜，而3-丙基取代時(shí)親和力降低撒顿。為了研究Hsp90α選擇性抑制劑與Hsp90α的結(jié)合模式，將化合物12b和12d與Hsp90α的N-端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行共晶研究荚板。結(jié)果表明凤壁，化合物12b的乙二氧環(huán)通過保守的水分子與Tyr139相互作用，增加了結(jié)合力跪另，而化合物12d不與Tyr139形成額外氫鍵作用拧抖，進(jìn)一步證明了作者的假設(shè)。疏水性的占據(jù)位點(diǎn)1能夠通過減少熵罰而提高結(jié)合親和力免绿，這可能是12h親和力增加的原因唧席。同樣，4-苯酚通過水分子A和B與Ser52相互作用(圖4和9a,b)嘲驾。因此淌哟，包含苯硫醚的化合物對Hsp90α的選擇性能夠通過非選擇性抑制劑化合物1和化合物12b與Hsp90α結(jié)合模式的重疊分析得到合理解釋。如圖9c所示距淫，5位苯硫醚和4-苯酚的存在誘導(dǎo)Hsp90α構(gòu)象的改變绞绒，導(dǎo)致位點(diǎn)1開放。此外榕暇，硫醚片段的方向不同于嘌呤類Hsp90泛抑制劑(圖9d)蓬衡。Hsp90α與12b和12d的共晶結(jié)構(gòu)表明，化合物能夠誘導(dǎo)4-苯酚靠近Ser52彤枢，引起硫醚向腺嘌呤結(jié)合口袋移動(dòng)(圖9c)狰晚。因此，Hsp90α優(yōu)先結(jié)合含有4-苯酚的苯硫醚衍生物缴啡。

圖8 化合物12b(a)和12d(b)與Hsp90α的共晶結(jié)構(gòu)壁晒，化合物12b和1結(jié)合于Hsp90α的重疊共晶結(jié)構(gòu)(c)，化合物12b和PU-H71結(jié)合于Hsp90α的重疊共晶結(jié)構(gòu)(d)

利用化合物5和12d進(jìn)行NCI-60癌細(xì)胞篩選业栅，以確定Hsp90α選擇性抑制劑的細(xì)胞響應(yīng)秒咐。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H522谬晕、黑色素瘤細(xì)胞UACC-62、卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和腎細(xì)胞癌細(xì)胞UO-31的生長被選擇性抑制携取。用高濃度的12h處理NCI-H522細(xì)胞攒钳，測定Hsp90客戶蛋白的降解情況，Hsp90客戶蛋白Her2雷滋、Raf-1和Akt的水平以劑量依賴性方式降低不撑。與Hsp90α依賴性的客戶蛋白c-Src相比，Hsp90β依賴性的CDK4在更高濃度的12h時(shí)才會(huì)發(fā)生降解晤斩，表明在細(xì)胞內(nèi)化合物優(yōu)先抑制Hsp90α焕檬。Hsp90α依賴性的客戶蛋白生存素在12h處理時(shí)也呈劑量依賴性下降。與Hsp90泛抑制劑(如GDA)相比澳泵，Hsp70水平僅有低程度的誘導(dǎo)升高实愚。低濃度的12h能夠誘導(dǎo) Hsp90水平升高，而高濃度時(shí)則降低烹俗。此外爆侣，高濃度12h處理時(shí) HSF1水平也降低了(圖10)。

圖9 化合物12h處理后幢妄，利用Western blot 分析NCIH522細(xì)胞中客戶蛋白情況兔仰，陰性對照DMSO，陽性對照格爾德霉素(GDA, 500 nM)

蛋白或酶亞型選擇性抑制劑的設(shè)計(jì)和開發(fā)一直是藥物化學(xué)中最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一蕉鸳，亞型蛋白序列和構(gòu)象高度相似的情況下尤為如此乎赴。配體結(jié)合位點(diǎn)僅有兩種氨基酸差異的Hsp90α和Hsp90β亞型選擇性抑制劑的開發(fā)是藥物化學(xué)家面臨重要挑戰(zhàn)。先前研究利用兩種氨基酸的差異發(fā)現(xiàn)了Hsp90β選擇性抑制劑潮尝，但同樣的方法應(yīng)用于Hsp90α選擇性抑制劑的開發(fā)并沒有取得成功榕吼。基于各種酚類化合物的作用分析獲得的新型先導(dǎo)化合物3對Hsp90α的選擇性約為Hsp90β的10倍勉失「迹基于此，作者通過基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計(jì)最終發(fā)現(xiàn)了首個(gè)Hsp90α選擇性抑制劑12h乱凿，其Hsp90α抑制IC50為460 nM顽素，選擇性是Hsp90β的48倍，能夠選擇性抑制NCI篩選中多種癌細(xì)胞的生長徒蟆。低濃度時(shí)胁出，Hsp90α選擇性抑制劑能夠誘導(dǎo)Hsp90α依賴性的底物蛋白降解，不影響Hsp90β依賴性的客戶蛋白段审∪總之，作者以基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)策略發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)Hsp90α選擇性抑制劑，為Hsp90亞型選擇性抑制劑的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供了重要方向抑淫，具有重要意義绷落。

參考文獻(xiàn)：

1. Sanket J. Mishra, Anuj Khandelwal, et al. Selective Inhibition of the Hsp90α Isoform. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 10547-10551.

2. Li Li, Lei Wang, et al. Heat Shock Protein 90 Inhibitors: An Update on Achievements, Challenges, and Future Directions. J. Med. Chem. 2020, 63, 1798-1822.

3. Ren Jing, Yan Bi-bo, et al. Progress in the study of small molecule inhibitors of HSP90. Acta Pharmacol. Sin. 2015, 50, 640-649.

4. Xue Nina, Jin Jing, Chen Xiaoguang. Co-chaperones: regulated action in conformational functions of HSP90 and their actions in cancer. Acta Pharmacol. Sin. 2017, 52, 1085-1090.

5. Anuj Khandelwal, Caitlin N. Kent, et al. Structure-guided design of an Hsp90β N-terminal isoform-selective inhibitor. Nat. Commun. 2018, 9, 425.