流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry ，F(xiàn)CM）是一種對(duì)液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)坐搔。
一贼涩、小妖精的成仙之路
二、樣本類型
流式細(xì)胞儀可檢測(cè)多種樣本：外周血薯蝎、骨髓、細(xì)胞穿刺液谤绳、洗脫液占锯、實(shí)體組織袒哥、培養(yǎng)細(xì)胞、微生物消略。
三堡称、工作原理
流式細(xì)胞儀主要由3部分組成：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)艺演、電子系統(tǒng)却紧。進(jìn)行熒光染色后的待測(cè)細(xì)胞會(huì)在一定氣體壓力下被壓入流動(dòng)室，在鞘液的包裹下待測(cè)細(xì)胞呈單行排列胎撤，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域晓殊，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下會(huì)產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號(hào)會(huì)同時(shí)被光電倍增管( PMT) 接收伤提。接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)巫俺，再通過(guò)模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)肿男。
四介汹、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用
五、操作過(guò)程中的注意點(diǎn)
1舶沛、上機(jī)前處理
小心熒光淬滅
操作時(shí)必須嚴(yán)格按照孵育時(shí)間嘹承，如果抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熒光是會(huì)逐漸淬滅的如庭。那如果不得不推遲實(shí)驗(yàn)怎么辦叹卷？可以把試管放在冰里面，這樣會(huì)稍稍延長(zhǎng)淬滅的時(shí)間柱彻。
注意染色順序
在進(jìn)行多熒光染色的時(shí)候豪娜，相同的細(xì)胞會(huì)因?yàn)槿旧樞虿煌鴮?dǎo)致熒光強(qiáng)度的差異。解決辦法為：預(yù)實(shí)驗(yàn)哟楷。做一系列的不同染色順序的樣本瘤载，通過(guò)對(duì)染色前和染色后的各種樣本進(jìn)行比較分析，判斷染色順序?qū)?xì)胞造成的影響卖擅。
選好染色方案
染色方案不合理也可能會(huì)導(dǎo)致熒光染色信號(hào)太弱鸣奔。解決的方案：預(yù)實(shí)驗(yàn)。在正式開始實(shí)驗(yàn)之前惩阶，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)挎狸，設(shè)計(jì)出一個(gè)完美的染色方案。（考慮試劑種類断楷，試劑質(zhì)量锨匆，試劑用量，孵育時(shí)間冬筒，洗滌次數(shù)恐锣，染料濃度茅主，染色時(shí)間及染色溫度等其他因素。）
做好陰性對(duì)照及同型對(duì)照試驗(yàn)
細(xì)胞陰性對(duì)照可以顯示細(xì)胞基準(zhǔn)的熒光水平土榴。
同型對(duì)照則是為了查看抗體非特異性結(jié)合的水平诀姚。選擇同型對(duì)照需要注意采用相同物種、相同亞類玷禽、相同染料赫段、相同濃度，否則矢赁，檢測(cè)的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)亂七八糟的同型對(duì)照結(jié)果糯笙。
選擇合適的抗體
通用原則是：為表達(dá)最弱的抗原選擇染色指數(shù)最高的熒光素。根據(jù)使用的流式細(xì)胞儀性能坯台、激光器炬丸、濾光片種類來(lái)選擇。對(duì)于多色實(shí)驗(yàn)蜒蕾，需選擇發(fā)射光譜重疊小的染料稠炬。
2、參數(shù)設(shè)定
數(shù)據(jù)的獲取必須是在儀器性能的校準(zhǔn)均合格的基礎(chǔ)上進(jìn)行咪啡。儀器散射光和熒光信號(hào)的光電倍增管電壓首启、增益、顏色補(bǔ)償?shù)葏?shù)的設(shè)定會(huì)直接影響結(jié)果撤摸。
電壓
電壓的調(diào)節(jié)需根據(jù)陰性對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)毅桃。
閾值
可以以任意參數(shù)及多個(gè)參數(shù)的組合作為閾值；大多數(shù)樣本都可以設(shè)定FSC/SSC准夷；閾值以下的信號(hào)不存儲(chǔ)钥飞；可以根據(jù)陰性對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)。
目的是將不需要的雜質(zhì)信號(hào)衫嵌，噪音信號(hào)读宙，無(wú)用的細(xì)胞信號(hào)等扣除，使收集到的都是有用信號(hào)楔绞。
補(bǔ)償
流式細(xì)胞分析中經(jīng)常要用到2種以上的熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色结闸，而目前所使用的多種熒光染料發(fā)射譜間有一定重疊。熒光補(bǔ)償則可以從探測(cè)器種除去匹配熒光以外的任何熒光信號(hào)酒朵。
補(bǔ)償方式：任意兩個(gè)通道之間都可以調(diào)節(jié)桦锄。
補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)：根據(jù)單染對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)。
六蔫耽、數(shù)據(jù)分析
流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的各種參數(shù)都是通過(guò)光信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)的结耀。光信號(hào)包括了散射光信號(hào)和熒光信號(hào)。散射光信號(hào)包括前向角散射（FSC，反應(yīng)細(xì)胞的大斜恰）和側(cè)向角散射（SSC香伴，反應(yīng)細(xì)胞顆粒度）。熒光信號(hào)可以用來(lái)反應(yīng)細(xì)胞的抗原表達(dá)等化學(xué)特性具则。
流式圖的種類非常多，最常用的是流式直方圖和流式散點(diǎn)圖具帮。
直方圖
流式直方圖只能顯示一個(gè)通道的信息博肋。
橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，單位是對(duì)數(shù)蜂厅，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)匪凡。縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)掘猿。
散點(diǎn)圖
X坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)相對(duì)含量病游，Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量，可以將細(xì)胞亞群分開稠通。
FSC和SSC是流式中兩個(gè)非吵某模基本的參數(shù)，F(xiàn)SC的值能代表細(xì)胞的大小改橘，細(xì)胞的體積越大滋尉，其FSC就越大。SSC則代表細(xì)胞的顆粒度飞主，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和顆粒度越大狮惜，則SSC越大。分析外周血細(xì)胞時(shí)碌识，就可以利用FSC和SSC的特性把細(xì)胞分為淋巴細(xì)胞碾篡、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞（左圖）。
右圖中可以看到X軸為CD3筏餐，Y軸為CD4开泽，四個(gè)象限表示：左上是CD3-CD4+，左下是CD3-CD4-胖烛，右上是CD3+CD4+眼姐，右下是CD3+CD4-。
等高線和密度圖
等高圖：類似于地圖中的等高線佩番，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等众旗，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。
密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多趟畏，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞越少贡歧。
三維圖
作者：向日葵
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