m6A RNA Methylation Is Regulated by MicroRNAsandPromotes Reprogramming to Pluripotency

摘要：m6A目前已經(jīng)被確認(rèn)為真核生物mRNA保守性的表觀修飾萝喘，但是其在細(xì)胞“重新編程”過程中的特點(diǎn)顾复、調(diào)控機(jī)制和功能還了解的很少。本文通過比較分析基因和細(xì)胞特異性的mRNAm6A甲基化的幾個(gè)特點(diǎn)乐严，揭示了4種不同分化程度的多功能細(xì)胞mRNA的m6A修飾。

另外，本文還展示了microRNA通過堿基互補(bǔ)調(diào)控RNA的m6A修飾，miRNA的表達(dá)或序列通過METTL3結(jié)合到mRNA的miRNA結(jié)合位點(diǎn)上改變mRNA的甲基化水平攘须。m6A水平的增加促進(jìn)小鼠纖維母細(xì)胞向多功能干細(xì)胞分化，而m6A水平的降低則阻礙分化殴泰。這些結(jié)果揭示了microRNA在Mrna甲基化上的一種功能于宙，為未來研究m6A在細(xì)胞“重新編程”過程中的功能提供新的依據(jù)浮驳。

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1、meRIP-sep分析：m6A在mRNA的microRNA結(jié)合位點(diǎn)上富集

為了探究m6A的序列特點(diǎn)捞魁，作者通過meRIP-seq的方法對(duì)所有細(xì)胞類型進(jìn)行了m6A位點(diǎn)的分析至会，發(fā)現(xiàn)所有類型細(xì)胞有87%的M6A峰值位于GGACU上；在包含m6A的序列中有67%–89%與miRNA序列的5’端能進(jìn)行反向互補(bǔ)谱俭，說明這些位點(diǎn)可能是microRNA的結(jié)合靶標(biāo)位點(diǎn)奉件。如下圖：

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圖注：A是各種類型細(xì)胞中m6A峰值富集的共同motif序列；B是共同的m6A motif與相應(yīng)microRNA的互補(bǔ)配對(duì)情況昆著；C是另外兩種m6A富集的Motif與相應(yīng)microRNA互補(bǔ)配對(duì)的情況县貌；D是microRNA靶標(biāo)的m6A富集的motif的百分比。

2凑懂、microRNA通過影響METTL3與mRNA的結(jié)合煤痕，影響M6A水平。

（1）Dicer敲低使m6A水平下降接谨，dicer過表達(dá)使m6A水平上升摆碉。

為了探究microRNA對(duì)m6A修飾是否產(chǎn)生影響，作者分別對(duì)小鼠NSC和人Hela細(xì)胞的dicer酶（對(duì)ciroRNA前體加工使其形成成熟miroRNA的限制性內(nèi)切酶）進(jìn)行過表達(dá)和敲低處理后疤坝，對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行m6A dot blot檢測(cè)m6A的相對(duì)含量兆解，同時(shí)WB檢測(cè)甲基化酶METT3和去甲基化酶FTO的表達(dá)，表明dicer酶過表達(dá)后RNA的m6A含量升高dicer酶敲低后RNA的m6A含量降低跑揉，而與甲基化相關(guān)的修飾沒表達(dá)并不受影響，說明RNA的m6A修飾受dicer酶表達(dá)水平的影響埠巨。如下圖：

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圖注：A和B是dicer酶過表達(dá)后的m6A dotblot檢測(cè)RNA的m6A含量和WB檢測(cè)甲基化相關(guān)的修飾酶历谍；C和D是dicer酶敲低后的m6A dot blot檢測(cè)RNA的m6A含量和WB檢測(cè)甲基化相關(guān)的修飾酶。

（2）microRNA促進(jìn)mRNA的甲基化

為了探究microRNA是否調(diào)控m6A的形成辣垒，作者從與m6A富集的mitif配對(duì)的MicroRNA中隨機(jī)選擇幾種MicroRNA在小鼠NSC細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)和敲低后Q-PCR檢測(cè)m6A的含量望侈，表明microRNA過表達(dá)使m6A升高，microRNA敲低后m6A含量降低勋桶。說明microRNA對(duì)m6A的形成具有促進(jìn)作用脱衙。如下圖：

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圖注：A為隨機(jī)選擇的幾種microRNA在小鼠NSC細(xì)胞中過表達(dá)后Q-PCR檢測(cè)相應(yīng)mRNA的m6A形成情況；B為microRNA在小鼠NSC細(xì)胞中敲低后Q-PCR檢測(cè)相應(yīng)mRNA的m6A形成情況例驹。說明microRNA促進(jìn)其靶標(biāo)mRNA的m6A修飾捐韩。

（3）microRNA通過介導(dǎo)METTL3與mRNA結(jié)合促進(jìn)RNA的m6A修飾

上面的研究表明microRNA促進(jìn)mRNA的甲基化修飾，于是作者推測(cè)microRNA通過介導(dǎo)RNA甲基化修飾酶METTL3結(jié)合到mRNA上進(jìn)行m6A修飾鹃锈。為了驗(yàn)證這個(gè)猜想荤胁，作者首先檢測(cè)dicer的表達(dá)是否會(huì)影響METTL3的細(xì)胞定位和功能，通過核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明dicer的表達(dá)不會(huì)影響METTL3的細(xì)胞分布屎债；隨后作者通過CLIP驗(yàn)證microRNA對(duì)mRNA與METTL3結(jié)合的影響仅政，dicer酶敲低使得METTL3與mRNA的結(jié)合降低垢油。如下圖：

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圖注：A是核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)METTL3的細(xì)胞定位和分布；B和C是dicer酶敲低后用帶Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行的CLIP實(shí)驗(yàn)圆丹，表明dicer敲低后METTL3與RNA結(jié)合降低滩愁。

接著為了更直接的說明microRNA對(duì)METTL3和mRNA結(jié)合的影響，作者通過METTL3的RIP-QPCR檢測(cè)microRNA過表達(dá)后mRNA與METTL3的結(jié)合辫封，說明microRNA對(duì)METTL3與mRNA的結(jié)合具有促進(jìn)作用硝枉。如下圖：

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圖注：對(duì)幾種microRNA進(jìn)行過表達(dá)后，用METT3抗體進(jìn)行RIP獲取與METTL3結(jié)合的RNA,然后q-pcr檢測(cè)相應(yīng)結(jié)合的mRNA秸讹，表明microRNA對(duì)METTL3與mRNA結(jié)合有影響檀咙。

3、m6A的活躍促進(jìn)細(xì)胞的“重新編程”功能

為了研究m6A對(duì)細(xì)胞功能的影響璃诀，作者分別對(duì)METTL3進(jìn)行過表達(dá)和敲低使m6A修飾增加和降低后檢測(cè)細(xì)胞的干性分化情況：檢測(cè)干性相關(guān)基因表達(dá)弧可。表明m6A修飾與細(xì)胞干性正相關(guān)。

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圖注：分別對(duì)METTL3進(jìn)行過表達(dá)和敲低后檢測(cè)干性相關(guān)基因的表達(dá)情況劣欢。

文獻(xiàn)原文：TongChen,Ya-Juan Hao,YingZhang,et al.m6A RNA Methylation Is Regulated by MicroRNAsandPromotes Reprogramming to Pluripotency[J].Cell Stem Cell,2015,16,289–301