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細(xì)胞狀態(tài)的可塑性被認(rèn)為是導(dǎo)致對多種癌癥療法產(chǎn)生抗藥性的原因春塌，從而限制了它們的有效性（也就是EMT其實）。在人類腫瘤和癌細(xì)胞系中觀察到的一種高間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)與不同癌癥譜系對多種治療方式的耐藥性有關(guān)，但這種狀態(tài)的機(jī)制基礎(chǔ)仍不完全清楚摔笤。在這里够滑，我們從分子上描述了人類癌細(xì)胞系和有機(jī)體中這種耐藥的高間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)，并表明它依賴于一種可抑制鐵死亡的脂質(zhì)過氧化物途徑吕世，我們表明彰触，這種細(xì)胞狀態(tài)的特征是促進(jìn)多不飽和脂質(zhì)合成的酶的活性。這些脂質(zhì)是脂氧合酶酶進(jìn)行脂質(zhì)過氧化的底物命辖。這種脂質(zhì)代謝依賴于聚集在磷脂谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx4)上的途徑况毅，Gpx4是一種含硒半胱氨酸的酶，可以驅(qū)散脂質(zhì)過氧化物尔艇，從而阻止鐵介導(dǎo)的過氧化物反應(yīng).研究發(fā)現(xiàn)尔许，對Gpx4的依賴性存在于以ZEB1高表達(dá)為特征的多種耐藥狀態(tài)，包括上皮源性癌癥的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化终娃、黑色素瘤的轉(zhuǎn)化生長因子β介導(dǎo)的治療耐藥味廊、前列腺癌治療誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化以及肉瘤，這些腫瘤由于其起源的細(xì)胞而固定在間質(zhì)狀態(tài)棠耕。我們發(fā)現(xiàn)余佛，在不同的間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)下，抑制脂質(zhì)過氧化物酶途徑導(dǎo)致的鐵死亡是耐藥癌細(xì)胞的一個特征窍荧。
我們假設(shè)培養(yǎng)細(xì)胞存在不同狀態(tài)辉巡，通過挖掘腫瘤細(xì)胞系對活性與體細(xì)胞系表達(dá)抗性標(biāo)志相關(guān)的化合物的敏感性可以用來研究抗性狀態(tài)細(xì)胞的弱點，為了探索這一點蕊退，我們選擇了三個細(xì)胞和患者來源的高間質(zhì)狀態(tài)的簽名郊楣。我們首先計算了516個上皮來源的癌細(xì)胞(癌癥)的間質(zhì)評分，用于產(chǎn)生癌癥治療反應(yīng)門戶網(wǎng)站上可用的小分子敏感性測量瓤荔【辉椋基因表達(dá)數(shù)據(jù)從CCLE門戶網(wǎng)站獲得。我們使用與治療耐藥相關(guān)的間充質(zhì)狀態(tài)的基因表達(dá)簽名進(jìn)行了單樣本基因集富集分析茉贡。將這些細(xì)胞系間充質(zhì)分?jǐn)?shù)與細(xì)胞系敏感性的曲線下面積(AUC)度量(從16個濃度一式兩次測量)關(guān)聯(lián)到481個性能不同的化合物塞栅，產(chǎn)生了一系列化合物敏感性-間充質(zhì)分?jǐn)?shù)相關(guān)系數(shù)(圖1A和補充表2)。酪氨酸激酶抑制劑可以抑制上皮癌細(xì)胞靶點(例如表皮生長因子受體)腔丧，是與上皮細(xì)胞狀態(tài)敏感性最相關(guān)的化合物之一放椰，增加了我們對這一方法的信心(圖1A)。此外愉粤，ML239砾医，一種最初被確定為具有優(yōu)先殺死經(jīng)過EMT誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的能力的化合物，最近被證明可以增加癌細(xì)胞中的不飽和脂質(zhì)水平衣厘，與間質(zhì)狀態(tài)敏感性相關(guān)如蚜，進(jìn)一步驗證了這一策略(圖1A和補充表2)压恒。
除了脂質(zhì)修飾化合物ML239，兩類不同的化合物與具有高間充質(zhì)狀態(tài)基因表達(dá)分?jǐn)?shù)的上皮癌細(xì)胞系的選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞死亡強烈相關(guān)(圖1A)错邦。第一類包括RSL3探赫、ML210和ML162，已知可誘導(dǎo)鐵死亡撬呢，這是一種涉及脂質(zhì)過氧化的非凋亡伦吠、氧化形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(圖1B)。第二類包括氟伐他汀魂拦、洛伐他汀酸和辛伐他汀毛仪，抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)的化合物(他汀類)(圖1B)。我們將這七個化合物統(tǒng)稱為間充質(zhì)狀態(tài)靶向化合物芯勘。
八種胰腺和胃癌細(xì)胞系的E-cadherin(一種典型的上皮狀態(tài)標(biāo)志物)的低水平和Vimentin(一種間質(zhì)狀態(tài)的標(biāo)志物)的高平與細(xì)胞系對間質(zhì)狀態(tài)靶向化合物的敏感性之間的相關(guān)性進(jìn)一步驗證了這些化合物的間質(zhì)狀態(tài)靶向效應(yīng)(圖1C和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1箱靴、2)。除了對高表達(dá)間充質(zhì)狀態(tài)基因的上皮癌細(xì)胞株表現(xiàn)出選擇性外荷愕，誘導(dǎo)鐵死亡的間充質(zhì)狀態(tài)靶向化合物對于間充質(zhì)起源的癌細(xì)胞系(肉瘤)是最具選擇性的化合物(圖1D)衡怀。來自卵巢癌和腎癌的細(xì)胞系也顯示了鐵死亡誘導(dǎo)間充質(zhì)狀態(tài)靶向化合物的選擇性靶向(圖1D)。我們假設(shè)這源于卵巢和腎臟的間充質(zhì)中腎胚胎起源安疗，并保留了間充質(zhì)狀態(tài)狈癞，即卵巢和腎癌在這些組織中的易損性。
使用可公開獲得的349個癌細(xì)胞系的全基因組短發(fā)夾狀RNA(ShRNA)敏感性數(shù)據(jù)茂契，我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞系對Gpx4基因敲除的敏感性是對鐵死亡誘導(dǎo)的化合物子集敏感的相關(guān)性最高(圖2A和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3)慨绳。這表明這些化合物的特征在于它們獨特的抑制Gpx4的能力掉冶，鑒于Gpx4被確認(rèn)為RSL3的相關(guān)直接靶標(biāo)，這一假說特別吸引人脐雪。
他汀類藥物是HMGCR的小分子抑制劑厌小，它們可能通過影響硒代半胱氨酸荷電轉(zhuǎn)移rna(Trna)的異戊烯化(作為硒代半胱氨酸-tRNA成熟的一部分)來介導(dǎo)它們選擇性誘導(dǎo)高間質(zhì)狀態(tài)癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡(圖1A)。
他汀類藥物通過甲羥戊酸途徑抑制焦磷酸異戊烯酯的產(chǎn)生战秋，從而抑制硒蛋白的生物合成璧亚。他汀類藥物和直接Gpx4抑制劑在CTRP AUC相似矩陣(圖2B)的層級聚類中相鄰聚類(旨在識別在數(shù)百個癌細(xì)胞系中具有相似敏感性模式的化合物)，支持他汀類藥物的作用機(jī)制脂信，該機(jī)制與直接Gpx4抑制劑密切相關(guān)癣蟋，但與直接Gpx4抑制劑不同。
用氟伐他汀處理細(xì)胞后狰闪，Gpx4的表達(dá)以時間和濃度依賴的方式減少(圖2C和補充圖1)疯搅，并與直接Gpx4抑制劑RSL3(圖2D)協(xié)同處理。與直接Gpx4抑制劑的作用不同埋泵，他汀類藥物的治療不能被脂溶性抗氧化劑拯救(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5)幔欧。
然而罪治，他汀類藥物治療導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平增加(圖2e)，這與抑制Gpx4蛋白表達(dá)一致礁蔗。
為了更深入地了解高間質(zhì)狀態(tài)和Gpx4依賴性之間的關(guān)系觉义，我們分析了幾個模擬癌癥相關(guān)間充質(zhì)狀態(tài)的等位基因細(xì)胞系。由強制表達(dá)EMT轉(zhuǎn)錄因子SNAIL1(也稱為SNAI1)或Twist1衍生的高間質(zhì)狀態(tài)癌細(xì)胞對Gpx4抑制沒有顯示出一致的敏感性(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6)浴井。相反晒骇，我們發(fā)現(xiàn)EMT調(diào)節(jié)因子和脂質(zhì)生成因子ZEB1與間充質(zhì)狀態(tài)對Gpx4抑制的敏感性密切相關(guān)(圖3A)。更重要的是滋饲，ZEB1缺失消除了對Gpx4抑制的敏感性(圖3B厉碟，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7和補充圖1)，表明ZEB1對于高間質(zhì)狀態(tài)細(xì)胞對Gpx4的依賴是必需的屠缭。
靶向治療后出現(xiàn)的高間質(zhì)狀態(tài)代表了另一種耐藥間充質(zhì)癌細(xì)胞狀態(tài)的等位基因模型箍鼓。我們發(fā)現(xiàn)，與親本HCC4006細(xì)胞相比呵曹，獲得高間質(zhì)狀態(tài)并對gefinitib具有耐藥性的HCC4006非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對Gpx4抑制具有優(yōu)先敏感性(圖3C和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8)款咖。
兩個患者來源的胰腺癌細(xì)胞系被發(fā)現(xiàn)對Gpx4抑制劑的敏感性與間質(zhì)狀態(tài)蛋白標(biāo)記物的水平呈正相關(guān)，而與對厄洛替尼的敏感性呈負(fù)相關(guān)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1)奄喂。前列腺癌背景下的神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化可以產(chǎn)生耐藥細(xì)胞铐殃，間質(zhì)狀態(tài)基因的表達(dá)增加。在一組表現(xiàn)出一系列上皮和間質(zhì)特征的患者來源的前列腺癌類器官和良性前列腺細(xì)胞中跨新，我們發(fā)現(xiàn)治療誘導(dǎo)的富腊、高ZEB1的神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)變與Gpx4依賴有選擇性地相關(guān)(圖3D和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8)。
在BRAF突變型黑色素瘤的背景下域帐，在人類腫瘤中觀察到的一種非突變細(xì)胞狀態(tài)與靶向治療和免疫治療有關(guān)赘被。這種黑色素瘤治療耐受狀態(tài)類似于激活的成纖維細(xì)胞(例如肌成纖維細(xì)胞)，其特征是包括AX1在內(nèi)的間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)增加肖揣，黑素細(xì)胞系特異性轉(zhuǎn)錄因子MITF的表達(dá)降低民假，并且可以通過轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)對治療敏感的細(xì)胞。
我們發(fā)現(xiàn)龙优，這種黑色素瘤治療耐藥狀態(tài)的基因表達(dá)特征與CTRP內(nèi)對Gpx4抑制劑的敏感性密切相關(guān)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8)羊异，用轉(zhuǎn)化生長因子β治療兩個對治療敏感的患者來源的黑色素瘤細(xì)胞系導(dǎo)致了對BRAF抑制的抵抗并誘導(dǎo)了Gpx4依賴(圖3e)。
當(dāng)我們試圖證明Gpx4在活體中作為間充質(zhì)狀態(tài)依賴性保持完好時彤断，我們遇到了現(xiàn)有Gpx4抑制劑的藥代動力學(xué)缺陷野舶，這排除了它們在動物中的使用。為了繞過這一挑戰(zhàn)宰衙，我們使用了一種利用脂溶性抗氧化劑(例如筒愚，維生素E)，鐵抑素-1挽救Gpx4缺失的影響菩浙。我們使用CRISPR-Cas9技術(shù)在一組癌細(xì)胞系(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7和補充圖1)中敲除Gpx4巢掺。這是在fer-1存在的情況下實現(xiàn)的句伶，允許依賴于Gpx4的Gpx4基因敲除細(xì)胞存活。當(dāng)存在fer-1時陆淀，上皮和間質(zhì)狀態(tài)的Gpx4敲除癌細(xì)胞的增殖速度與它們的野生型(Gpx4-野生型)癌細(xì)胞相當(dāng)(圖3F)考余。fer-1的退出揭示了Gpx4功能的喪失，導(dǎo)致間充質(zhì)狀態(tài)Gpx4基因敲除細(xì)胞中的鐵死亡轧苫，而上皮狀態(tài)Gpx4基因敲除細(xì)胞仍然沒有受到影響(圖3F)楚堤。
我們通過優(yōu)化小鼠的fer-1劑量策略，使依賴于Gpx4的Gpx4基因敲除的癌細(xì)胞能夠存活含懊，從而使這種方法適應(yīng)于體內(nèi)情況身冬。我們產(chǎn)生了高間充質(zhì)狀態(tài)、耐藥黑色素瘤細(xì)胞系LOXIMVI的Gpx4野生型和Gpx4基因敲除克隆的異種移植(圖3g)岔乔。停止給藥導(dǎo)致Gpx4基因敲除異種移植瘤選擇性消退酥筝，而Gpx4野生型異種移植瘤繼續(xù)快速生長(圖3g)。這些結(jié)果表明雏门，在細(xì)胞自主的情況下嘿歌，間充質(zhì)狀態(tài)對Gpx4的依賴在體內(nèi)保持完整，盡管在體外和體內(nèi)的代謝環(huán)境之間存在潛在的差異茁影。
Gpx4依賴性在采用耐藥間充質(zhì)狀態(tài)的癌細(xì)胞中比在一組未轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)細(xì)胞系中更為明顯(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9)宙帝。我們發(fā)現(xiàn)，通過用親脂性抗氧化劑如維生素E(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9募闲；也見圖4)預(yù)處理細(xì)胞步脓，可以進(jìn)一步擴(kuò)大這種區(qū)分敏感性，這些抗氧化劑間接補充了Gpx4的作用浩螺。例如沪编，與耐藥癌細(xì)胞相比，維生素E的保護(hù)作用在未轉(zhuǎn)化間充質(zhì)細(xì)胞中持續(xù)時間更長年扩，這讓人想起在甲氨蝶呤治療的背景下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞之間的葉酸差異效應(yīng)访圃。
通過擾動和功能表征厨幻，我們定義了一個由13個不同的分子節(jié)點組成的通路，該通路構(gòu)成了廣泛相關(guān)的間充質(zhì)治療耐藥狀態(tài)及其對脂質(zhì)過氧化物酶通路的依賴(圖4)腿时。這一途徑集中在合成况脆、儲存和使用長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)(例如花生四烯酸)，這些脂肪酸容易通過脂氧合酶的作用變成活性性脂質(zhì)過氧化物批糟。Gpx4可以驅(qū)散這些反應(yīng)性過氧化物格了，從而防止鐵鏈細(xì)胞死亡。與這一模型一致徽鼎，我們發(fā)現(xiàn)敲除PUFA代謝的上游調(diào)節(jié)因子(ACSL4盛末，LPCAT3)9和抑制脂氧合酶可以防止由于抑制Gpx4而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10)。
在這一主題上的趨同也與間充質(zhì)狀態(tài)靶向化合物ML239(圖1A)作用于脂肪酸去飽和酶-2(FADS2)以促進(jìn)多不飽和脂肪酸(PUFA)的生成一致，而多不飽和脂肪酸是脂質(zhì)過氧化的底物(圖4)审残。相反母廷，直接用過氧化脂質(zhì)處理細(xì)胞并不顯示對間充質(zhì)狀態(tài)細(xì)胞的選擇性(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10)。這一結(jié)果支持我們描述的耐藥間充質(zhì)狀態(tài)的Gpx4依賴的特征不是對外源性親脂過氧化物本身的敏感性檐嚣，而是特定細(xì)胞脂質(zhì)作為脂質(zhì)氧化酶底物的傾向(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10)助泽。
ZEB1，我們將其與Gpx4依賴性(圖3B)因果聯(lián)系嚎京，提供了間充質(zhì)基因表達(dá)和脂質(zhì)過氧化脆弱性之間的橋梁嗡贺。ZEB1已被證明在細(xì)胞脂質(zhì)新陳代謝中發(fā)揮重要作用，部分是通過直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂質(zhì)生物的主要調(diào)節(jié)因子PPARγ鞍帝。越來越多的證據(jù)表明诫睬，ZEB1調(diào)節(jié)脂質(zhì)的攝取、積累和動員膜眠，并影響EMT相關(guān)的質(zhì)膜重塑岩臣，這是脂氧合酶介導(dǎo)的多不飽和脂肪酸氧化發(fā)生的地方。由此產(chǎn)生的ZEB1高的細(xì)胞對脂質(zhì)過氧化物酶活性的依賴可以通過直接抑制Gpx4最有效地利用宵膨，但也可以通過抑制Gpx4生物合成(他汀類藥物)和調(diào)節(jié)Gpx4輔因子谷胱甘肽(Erastin架谎，丁硫氨酸亞砜)水平的代謝途徑的遠(yuǎn)端擾動來達(dá)到目的(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8)。
凋亡級聯(lián)的失調(diào)是處于治療抵抗?fàn)顟B(tài)的癌細(xì)胞的特征辟躏，這可能解釋了它們對不同治療模式的廣泛抵抗谷扣。我們的結(jié)果表明，這些細(xì)胞經(jīng)歷鐵死亡的能力增強了捎琐，更廣泛地說会涎，這里提出的結(jié)果說明了一種理解和克服癌癥治療耐藥性的方法，它超越了基于驅(qū)動癌基因和耐藥性突變的傳統(tǒng)方法瑞凑。
