由于Addgene的篇幅太長(zhǎng)除抛，因此決定分為至少兩個(gè)部分來介紹划址。
上期：來自Addgene的CRISPR指南（1）
參考：CRISPR Guide

由于這個(gè)部分已經(jīng)不是簡(jiǎn)單的看CRISPR guide了支子，中間還有查閱資料太惠，文獻(xiàn)閱讀的工作镰矿，因此沒有再冠以CRISPR Guide的名字阱穗。

9. Genome-Wide Screens Using CRISPR 精準(zhǔn)大海撈針，必學(xué)灾馒！

某天晚上我和師妹在微信上描述CRISPR screening實(shí)驗(yàn)時(shí)峡迷，她表示驚嘆說，師姐這難道不是精準(zhǔn)的大海撈針嗎？因此本期我們的文章標(biāo)題使用了師妹非常精辟的描述绘搞。在平時(shí)，我們要研究某基因的功能只能通過單獨(dú)敲低/敲除傅物、過表達(dá)的方式夯辖，而CRISPR screening允許我們同時(shí)進(jìn)行上萬個(gè)這樣的操作，一次搞定基因組范圍的基因編輯董饰，確可謂：精準(zhǔn)大海撈針蒿褂。

1. CRISPR Library

高通量是新時(shí)代生物技術(shù)的標(biāo)配，從能一次完成超過5萬個(gè)基因的PCR（RNA-seq）到細(xì)胞譜系追蹤（barcoding）卒暂，在不影響研究精準(zhǔn)度的情況下啄栓，大大的降低科學(xué)研究時(shí)間和成本。依據(jù)我們前面的介紹也祠，sgRNA將Cas9蛋白靶向至目的序列昙楚，Cas9結(jié)合到DNA上后剪切DNA得湘，那么以下這幾種情況則非常好理解：
（1）Cas9 + 1個(gè)sgRNA：針對(duì)一個(gè)基因進(jìn)行編輯还棱；
（2）Cas9 + 2個(gè)sgRNA：可針對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行編輯帘睦，或者可敲除兩個(gè)sgRNA之間的大DNA片段翼岁；
（3）Cas9 + 多個(gè)sgRNA：可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯蕉毯；
（4）Cas9 + 上萬個(gè)sgRNA：同時(shí)對(duì)上萬個(gè)基因進(jìn)行編輯羔沙。

針對(duì)第3艾船、4種情況琅攘，這多個(gè)sgRNA的合集被稱為CRISPR文庫(kù)（CRISPR Library）昔字，文庫(kù)的大小可從幾十個(gè)sgRNA到十幾萬個(gè)sgRNA爆袍。文庫(kù)的出現(xiàn)使得我們可以同時(shí)對(duì)上萬個(gè)基因進(jìn)行編輯，再篩選出對(duì)某特定表型有明顯作用的基因集作郭，用于指導(dǎo)下一步研究陨囊，這一過程稱為CRISPR screening，舉例如下圖：

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從上圖中可以看出所坯，CRISPR Library是包含sgRNA的pool（A-C）谆扎，并通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)入Cas9穩(wěn)定表達(dá)或野生型細(xì)胞（D），pool sgRNA感染的細(xì)胞經(jīng)過特定特征（耐藥性等）區(qū)分后芹助，通過NGS測(cè)序鑒定與特定特征相關(guān)的基因集堂湖。除了常規(guī)流程的展現(xiàn)，我們還需要注意到構(gòu)建pool library的工作量是相當(dāng)大的状土，如張峰教授組的GeCKO v2 Library可針對(duì)19,050個(gè)編碼基因无蜂，而為了提高編輯效率，每個(gè)基因都設(shè)計(jì)了至少6個(gè)sgRNA蒙谓，因此整個(gè)library包含有123,411個(gè)sgRNA斥季，每個(gè)sgRNA都要構(gòu)建出相應(yīng)質(zhì)粒，整個(gè)library的構(gòu)建花費(fèi)不菲，而我們只需要用500美元即可從Addgene上購(gòu)得酣倾，能夠使用這樣的工具舵揭，真得感謝這些巨人們。

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2. CRISPR Library的類型

CRISPR Library的類型也根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑晡⑽锓N午绳、文庫(kù)大小和投遞方式分類，具體信息可以在Addgene網(wǎng)頁(yè)上可以查看：

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在設(shè)計(jì)CRISPR screening實(shí)驗(yàn)之前需要思考以下問題：
（1）CRISPR screening在準(zhǔn)備階段需要使用電轉(zhuǎn)的方式擴(kuò)增文庫(kù)映之，并需要NGS測(cè)序來確定文庫(kù)豐度拦焚，盡管目前已經(jīng)有一些library可以選用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，但選用library之前一定要查閱清楚杠输；
（2）CRISPR screening實(shí)驗(yàn)需要大量的細(xì)胞赎败，因此對(duì)于一些無法擴(kuò)增、數(shù)量有限且非常珍貴的細(xì)胞時(shí)蠢甲，如原代細(xì)胞等僵刮，CRISPR screening則可能不適用；
（3）大多數(shù)CRISPR文庫(kù)需要使用慢病毒將gRNA/Cas9傳遞到目標(biāo)細(xì)胞峡钓。

因此妓笙，使用者需要充分考慮課題組的條件是否能達(dá)到以上要求。一旦確定實(shí)驗(yàn)條件適合能岩，那么下一步就是選擇library寞宫，在選擇文庫(kù)時(shí)，也需要考慮以下幾點(diǎn)：
（1）基因修飾的類型：敲除拉鹃、激活還是抑制目標(biāo)基因辈赋；
（2）gRNAs的數(shù)量：CRISPR Library可以針對(duì)整個(gè)基因組或某一類特定的基因，例如最近報(bào)道的用于增強(qiáng)CRT T細(xì)胞在實(shí)體瘤中活性的TCR pool knockin CRISPR Library膏燕，只有36個(gè)目的基因钥屈。
（3）物種：特定的CRISPRLibrary中的gRNAs對(duì)于特定生物體的基因組是唯一的，并且文庫(kù)只與來自該生物體的細(xì)胞兼容坝辫。
（4）library骨架：如骨架中已有Cas9篷就，則直接使用即可；如骨架中無近忙，需要搭配使用Cas9質(zhì)两咭担或者要求細(xì)胞本身就表達(dá)Cas9。

3. CRISPR Library的結(jié)構(gòu)

大部分的CRISPR Library都需要使用慢病毒投遞系統(tǒng)及舍，一般有這幾種骨架：LentiCRISPR和lentiGuide-Puro（如下圖）等未辆，區(qū)別在于前者的骨架中已帶有Cas9，因此是一個(gè)質(zhì)粒系統(tǒng)锯玛；而后者需要疊加使用一個(gè)Cas9質(zhì)粒咐柜。

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每個(gè)CRISPR文庫(kù)都是不同的兼蜈，然而大多數(shù)CRISPR文庫(kù)有幾個(gè)共同的特性：首先，每個(gè)基因文庫(kù)通常包含3-6個(gè)gRNAs拙友，以確保每個(gè)靶基因的編輯效果为狸，因此CRISPR文庫(kù)包含數(shù)千個(gè)針對(duì)多種基因的獨(dú)特gRNAs；CRISPR文庫(kù)的gRNA設(shè)計(jì)通常是優(yōu)化選擇high on-target和low off-target的gRNA遗契；敲除文庫(kù)通常針對(duì)5' 組成性表達(dá)的外顯子钥平，而激活和抑制文庫(kù)則針對(duì)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域。

雖然含有Cas9的慢病毒文庫(kù)是目前最流行的CRISPR篩選方法姊途，但它們并不適用于所有的細(xì)胞類型或?qū)嶒?yàn)。AAV骨架的哺乳動(dòng)物CRISPR文庫(kù)主要用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)知态，逆轉(zhuǎn)錄病毒形式的文庫(kù)可用于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差的細(xì)胞中捷兰。此外，由于技術(shù)問題负敏，CRISPR在細(xì)菌中的應(yīng)用較少贡茅，但仍有幾個(gè)細(xì)菌CRISPR文庫(kù)通過dCas9作用達(dá)到抑制效果。

4. CRISPR Library的設(shè)計(jì)和應(yīng)用舉例

在文章TSC1 and DEPDC5 regulate HIV-1 latency through the mTOR signaling pathway 中其做，作者為探討調(diào)控HIV病毒潛伏的關(guān)鍵基因顶考，作者首先構(gòu)建HIV的熒光報(bào)告細(xì)胞（HIV-1 proviral DNA+GFP），當(dāng)HIV病毒復(fù)制的時(shí)候妖泄，GFP也同時(shí)表達(dá)驹沿，因此可以通過綠色熒光來觀測(cè)HIV病毒的活動(dòng)情況。

在HIV-GFP報(bào)告細(xì)胞中蹈胡，轉(zhuǎn)入sgRNA library進(jìn)行大規(guī)脑荆基因敲除，一定時(shí)間后用FACS分選出強(qiáng)綠色熒光表達(dá)細(xì)胞罚渐，經(jīng)過4個(gè)循環(huán)后則得到了低熒光（HIV潛伏）和高熒光（HIV活動(dòng)）兩組細(xì)胞却汉，通過NGS測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞中的sgRNA豐度情況，經(jīng)過3次重復(fù)后得到257個(gè)基因?qū)IV病毒活動(dòng)有正向作用荷并，最后通過數(shù)據(jù)分析篩選出TOP的gene集合砂。后續(xù)可針對(duì)TOP基因集進(jìn)行針對(duì)性的驗(yàn)證。

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通過這個(gè)例子源织，我們還可以想象翩伪，把GFP細(xì)胞換成腫瘤藥耐藥細(xì)胞如厄洛替尼，將FACS分選換成給藥+不給藥兩組雀鹃，一定時(shí)間后檢測(cè)兩組細(xì)胞的sgRNA豐度差別幻工，則可以找到厄洛替尼耐藥相關(guān)的基因。

5. CRISPR Library實(shí)驗(yàn)的一些心得

（1）需要注意骨架中的啟動(dòng)子是否適合自己的目的細(xì)胞黎茎，例如CMV啟動(dòng)子非常廣譜囊颅，但對(duì)于人胚胎干細(xì)胞的效率則非常低，需要選用帶有EF1α啟動(dòng)子的骨架。
（2）部分library要求細(xì)胞本身就表達(dá)Cas9踢代，這本無可厚非盲憎，但部分細(xì)胞在高表達(dá)Cas9的情況下非常脆弱，這時(shí)候需要考慮使用inducible Cas9 system胳挎，而這個(gè)系統(tǒng)的構(gòu)建本身就是有難度的實(shí)驗(yàn)饼疙，因此在設(shè)計(jì)可提前一定要做好全面分析。
（3）Library擴(kuò)增工作量非常大慕爬，需要盡可能的嚴(yán)格按照protocol進(jìn)行窑眯，并且配備質(zhì)粒超大提試劑盒，部分Library要求使用特殊的感受態(tài)細(xì)胞医窿，而該細(xì)胞之外國(guó)外出售并且非常貴磅甩。
（4）由于Library非常龐大，慢病毒的包被也是大批量的姥卢，如果使用Lipo3000或者Roche的轉(zhuǎn)染試劑則花費(fèi)非常大卷要，此時(shí)可以考慮使用PEI40000等便宜且效果又好的轉(zhuǎn)染試劑。
（5）此外独榴，慢病毒的包被需要選擇狀態(tài)好且代數(shù)低的293T細(xì)胞僧叉，如果有293FT細(xì)胞則效果更佳。
（6）考慮篩選標(biāo)記的沖突棺榔，例如目的細(xì)胞是通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法穩(wěn)定表達(dá)Cas9瓶堕，且篩選標(biāo)記是puromycin，那么幾乎所有的Library的抗性篩選基因都是puromycin掷豺，這就沖突了捞烟。

具體更多的細(xì)節(jié)還需要我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。