為準(zhǔn)確了解某種蛋白功能，除需對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析外掉房，通常還需清楚其亞細(xì)胞定位茫陆，以此判斷其發(fā)揮功能的可能場所。就該問題而言刨肃，生物學(xué)中最常用的方法是給待研究的目的蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記古拴，其中最常見的熒光標(biāo)簽為綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）。
一真友、什么是融合表達(dá)黄痪？
通過基因構(gòu)建，將兩個獨(dú)立蛋白的編碼基因變成一個完整的閱讀框盔然，在表達(dá)過程中桅打，宿主會將這兩個基因當(dāng)作一個融合基因，從而表達(dá)出一個完整的大蛋白愈案。
OliC（啟動子）和 TrpC（終止子）共同啟動目的基因和GFP的融合表達(dá)和終止表達(dá)挺尾，利用GFP發(fā)光地位目的蛋白。
二站绪、利用GFP融合蛋白法進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位
- pC-NEO-N/CGFP載體-- 平板劃線法培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞 →大提質(zhì)粒
- GFP+ 目的基因（N端GFP）遭铺，目的基因+GFP（C端GFP）
- N端GFP的引物設(shè)計（46bp）--
F引物： 20bp載體序列+6bp酶切位點(diǎn)+目的基因的前20bp序列
R引物： 20bp載體序列+6bp酶切位點(diǎn)+目的基因的后20bp的反向互補(bǔ)序列 - C端GFP的引物設(shè)計（46bp）--
目的基因的編碼區(qū)去除終止密碼子后設(shè)計擴(kuò)增引物，此后同N端GFP的引物設(shè)計 - 提取WT菌株的 RNA 并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA恢准，以WT 菌株的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增魂挂，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 GFP基因起始密碼子的前面，構(gòu)建成目的蛋白與GFP 的融合表達(dá)載體
-
載體使用限制性內(nèi)切酶 SacⅠ和 XbaⅠ雙酶切（雙酶切可減少未被切開的載體馁筐，降低假陽性）
GFP融合蛋白的構(gòu)建.png
GFP分別連在Erg4A和Erg4B的C端以及Erg4C的N端.png
GFP載體圖譜1.png
