文獻閱讀：利用液滴條形碼測序技術對單個細胞外囊泡進行蛋白質分析

文獻信息

標題：Characterizing single extracellular vesicles by droplet barcode sequencing for protein analysis

DOI(url): https://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12277

日期及雜志：2022 Nov, J Extracell Vesicles

作者及單位：Mahsan Banijamali

文獻概述(這篇文獻的結論是什么？)

近年來，小細胞外囊泡(Small extracellular vesicles, sEV)已發(fā)展成為疾病診斷和治療隨訪的生物標志物來源牢裳。來自多細胞生物的sEV樣品顯示出高度異質性的囊泡庫参咙，這是目前基于集成測量的方法無法捕獲的。在這項工作中惰赋，我們提出了用于蛋白質分析的液滴條形碼測序(DBS-Pro)來分析單個sEV的表面蛋白宰掉，從而促進樣品內和樣品間sEV亞型的鑒定。該方法允許通過使用DNA條形碼親和試劑和測序作為readout分析多種蛋白質赁濒。高通量單囊泡分析是通過在乳化液液滴中對單個sEV進行區(qū)隔轨奄，然后通過PCR對液滴進行條形碼分析實現的。在這個概念驗證研究中拒炎，我們證明了DBS-Pro允許分析單個sEV挪拟，混合率低于2%。從非小細胞肺癌細胞系和非小細胞肺癌患者的惡性胸腔積液(MPE)液中獲得的總共超過120,000個sEV根據其表面蛋白進行了分析击你。該方法實現了單囊泡表面蛋白圖譜和sev亞型的擴展表征玉组，這對于在異質樣本中識別囊泡的細胞起源至關重要谎柄。

文獻結果(每個結果的圖片詳細解讀)

1、蛋白分析液滴條形碼測序(DBS-Pro)法原理

圖1描述了用于蛋白質分析的液滴條形碼測序(DBS-Pro)的概念惯雳，以及sEV在單囊泡分辨率下的定量蛋白質分析朝巫。囊泡用含有抗體特異性條形碼(antibody-specific barcode, ABC)和UMI的寡核苷酸偶聯抗體進行標記。用霍亂毒素亞基B (CTB)覆蓋的磁珠捕獲帶有抗體標記的囊泡吨凑，進行洗滌捍歪，然后被封裝在含有獨特的液滴條形碼(DBC)序列的乳化液液滴中。在每個液滴中鸵钝，ABC和DBC通過重疊延伸被放大和連接糙臼。對所得文庫進行測序，并對單個囊泡的表面蛋白進行鑒定和定量恩商。

Fig1

2变逃、單囊泡檢測的驗證

為了研究和驗證DBS-Pro法對單個囊泡的檢測(圖1)，本文使用從NSCLC細胞系H1975的細胞培養(yǎng)基中收集的sEV進行了一系列hashing experiments(圖2A)怠堪。兩組不同的條形碼寡核苷酸被用來標記CD9和EGFR抗體揽乱。在bead hashing中，囊泡與兩組在不同的反應管中孵育粟矿，并分別捕獲凰棉，并在形成液滴之前混合。在EV hashing中陌粹，囊泡與兩組在不同的反應管中孵育撒犀，但在它們被捕獲之前進行混合。(圖2B)顯示了bead hashing(n = 2)和EV hashing(n = 3)的Single set和混合速率掏秩。如果95%或更多的UMI只屬于一個集的ABC或舞，則認為液滴是Single set的。(圖2C)顯示基于每個單個囊泡的UMI計數的Single set和混合液滴蒙幻。hashing experiments清楚地表明映凳，DBS-Pro在至少98%的液滴中以單個囊泡分辨率生成數據。

Fig2

3邮破、DBS-Pro用于非小細胞肺癌細胞系sEV多重蛋白分析的驗證

為了研究該技術分析單個sEV上多個目標蛋白的潛力诈豌，本文使用11種蛋白進行了一系列DBS-Pro實驗。在培養(yǎng)的非小細胞肺癌H1975細胞株H1975_1决乎、H1975_2和H1975_3三個時間點的培養(yǎng)基中分離sev進行平行實驗队询。測序結果顯示，H1975_1构诚、H1975_2和H1975_3的單囊泡分別為8943個蚌斩、10054個和30350個。(圖3A)熱圖顯示基于log2轉換后UMI總數的數據。(圖3B)熱圖顯示含有液滴的比例送膳。(圖3C)小提琴圖顯示了每個液滴的UMI計數分布员魏。(圖4D)表示含有至少三個蛋白的液滴前兩個主成分(PCs)散點圖，沿各軸表示相對樣本密度叠聋，表明樣本之間有很好的重疊撕阎。

Fig3

4、非小細胞肺癌患者惡性胸腔積液單個囊泡的表面蛋白譜分析

在確定DBS-Pro能夠對單個sev的表面蛋白進行多重檢測后碌补，本文應用該方法對從不同腫瘤基因組改變的晚期NSCLC患者(PE002虏束、PE009和PE011)的MPE液中收集的單個sev進行蛋白譜分析。DBS-Pro法在PE002厦章、PE009和PE011樣品中分別檢測到9064镇匀、11920和4565個單囊泡。(圖4A)中的熱圖顯示了每個蛋白在DBC總數中的比例袜啃。結果表明汗侵，來自所有三種MPE樣品的sEV具有相對較高的CD9表達。(圖4B)顯示前30個蛋白組合占條形碼總數的比例群发。(圖4C)表示所有樣品的單個囊泡的UMAP降維結果晰韵，被分為了6個cluster。(圖4D)堆疊柱狀圖顯示了每個MPE樣本中sEV的相對比例熟妓。(圖4E) PE002雪猪、PE009和PE011樣品單個囊泡的UMAP圖，顯示每個樣品的密度起愈。(圖4F)熱圖顯示了每個蛋白的相對表達浪蹂。每一列代表一個液滴(即一個囊泡)。

Fig4

文獻方法(使用的生物信息學方法)

測序FASTQs使用DBS-Pro pipeline(https://github.com/FrickTobias/DBS-Pro, v0.3)處理告材。從讀取的每個序列中，分別使用cutadapt提取DBC和ABC+UMI組合古劲。DBC序列通過starcode聚類進行糾錯斥赋，編輯距離為2(參數' -d 2 ')。利用cutadapt與樣品中使用的已知ABC序列進行比較产艾，從每個ABC+UMI組合中確定目標(ABC)疤剑。對于每個校正的DBC和已識別的ABC，使用UMI-tools校正UMI序列闷堡。最后隘膘，對每個校正后的DBC、ABC和UMI組合的read count進行匯總杠览。

數據過濾弯菊。首先，為了去除背景和嵌合產物踱阿，只保留有一個以上讀取的UMI管钳，過濾掉只有一個UMI的DBC钦铁。為了去除攜帶多個DBC的液滴，使用Jaccard索引比較了UMI序列的成對重疊才漆。任何Jaccard索引大于0.5的DBC對都被刪除牛曹。對于來自H1975細胞培養(yǎng)基和MPE樣本的sEV，也去除了含有超過25個UMIs的DBC醇滥。從過濾的數據中生成一個計數矩陣黎比，其中包含每個DBC和ABC的UMI數量。

使用python包matplotlib, pandas, numpy, and seaborn畫圖鸳玩。UMAP和PCA 使用scanpy阅虫。首先，對液滴進行過濾怀喉，只保留有3個或更多蛋白的液滴书妻。然后使用蛋白水平上的中心對數比(CLR)變換對每個樣本的技術矩陣進行歸一化。UMAP參數n_neighbors = 100, min_dist = 0.9, 分辨率0.6躬拢。

文章亮點(這篇文獻的優(yōu)點在哪躲履？)

本文作為概念驗證研究邏輯非常清晰，首先驗證該方法是否能夠得到單個囊泡水平的數據聊闯，然后驗證了該方法在單個囊泡水平上能夠分析多個表面蛋白工猜，最后分析了非小細胞肺癌患者惡性胸腔積液的單囊泡表面蛋白譜作為例子
這個方法可以進行更多蛋白的良好擴展

我的疑問(這篇文獻的不足在哪？)

缺乏和同類型技術的比較

和我相關(我從這篇文獻里學到了什么菱蔬？)

可以通過圖4B以及其他進一步的研究進一步探尋常見的蛋白組合模式
本文的原理與PBA類似篷帅，實驗方法上與PBA略有不同，使用emPCR相較于PBA的滾環(huán)復制拴泌，暫時沒有看到具體的數據魏身，根據這個數據過濾情況判斷,感覺這篇文章產生的數據要比PBA好一點